附件99.1

奧密克戎和Ensovibep的多變量中和活性新冠肺炎：DARP治療新冠肺炎的候選藥物Charles G.Knutson，諾華生物醫學研究所，美國馬薩諸塞州劍橋市合著者：S.Rothenberger 1，M.Walser 2，F.Malvezzi 2，D.L.Hurdiss 3，J.Mayor 1，H.Moreno 1，S.Ryter 4，N.列支敦士登4，A.Bosshart 2，S.Mangold 2，F.Radom 2，K.Ramanathan 5，O.Enger 4，M.T.Stumpp 21洛桑大學，瑞士洛桑；2分子合作伙伴股份公司，蘇黎世-施利耶倫，瑞士；3烏得勒支大學，荷蘭烏得勒支；4斯皮茲實驗室，瑞士斯皮茲；5諾華製藥股份公司，瑞士巴塞爾背景·奧密克戎SARS-CoV-2變種已經改變了新冠肺炎大流行的格局。·奧密克戎的傳播率增加，並有能力逃避針對早期變種形成的自然或疫苗誘導的免疫，這有力地提醒人們，病毒進化的力量。·有可能產生多種效果的治療方法是有效管理大流行的關鍵組成部分。·ENSOVIBEP是一種一流的抗SARS-CoV-2 DARPin(設計的Ankyrin Repeat Protein)候選治療藥物，它使用三個具有相似對位的不同DARPin結構域(R1、R2、R3)與SARS-CoV-2刺突蛋白三聚體的受體結合域(RBD)的不同區域協同結合，從而阻止與宿主ACE2受體的相互作用。·RBD結合DARPin模塊的多特異性結合限制了尖峯蛋白突變對抗病毒效力的影響(圖1)。圖1。根據GISAID數據庫，SARS-CoV-2刺突蛋白點突變的全球頻率，包括包含ensovibep、R1、R2、R3的IC50值的熱圖表格, 所有被測試的點突變。IC50(ng/ml)0-10 11-20 21-50 51-100>100來自VSV/慢病毒檢測的RBD數據中的R1R2 R3突變；虛線框：受體結合域的突變。·基於結構數據的描繪，顯示RBD結合DARPin結構域(綠色、藍色、青色)與SARS-CoV-2刺突蛋白三聚體的RBD結合。另外兩個DARPin結構域(紫色)與人血清白蛋白(HSA)結合，以提供半衰期延長(圖2)。·我們在這裏提供的數據支持ensovibep的多變量效力。圖2.Ensovibep與SARS-CoV-2刺突蛋白結合。人血清白蛋白；RBD，受體結合域。方法以缺失糖蛋白基因(G)的重組VSV*Delg-Luc載體為基礎，構建VSV偽型病毒系統(CHUV)，並用綠色熒光蛋白和熒光素酶基因進行替換。野生型穗粒基於武漢-滬1號序列。將假病毒與Ensovibep的系列稀釋液混合，在37℃預孵育90min，然後加入預接種的VeroE6細胞。孵育90min後，去掉接種物，加入新鮮培養液，繼續孵育16h，根據One-Glo-Ift熒光素酶檢測系統裂解細胞。測量相對光單位，用非線性迴歸計算IC50值。更多細節可在Rothenberger等人的《2022》中找到。·通過共轉染pCMVDELR8.2，在293T細胞中產生了攜帶刺突蛋白和螢火蟲熒光素酶報告基因的慢病毒假病毒(Activ/FDA), Phr‘CMVLuc和pCDNA3.1(+)-尖峯突變體。野生型穗粒基於武漢-滬1號序列。假病毒與連續稀釋的Ensovibep在37℃預孵育2 h，然後加入預先接種的293T-ACE2.TMPRSS2s細胞。48h後通過檢測熒光素酶活性對假病毒感染進行評分，並用非線性迴歸計算IC50。更多細節可以在Neerukonda等人的《2021》中找到。·活的正宗病毒檢測(Spiez實驗室)：野生型病毒為法國分離株，與武漢-HU-1病毒相比有以下變化：V367F，E990A。連續稀釋的Ensovibep與100個TCID 50 SARS-CoV-2變異體在37℃預孵育1h，然後加入預種的VeroE6-TMPRSS2細胞。培養3d後，用CellTiter-Glo法檢測細胞存活率。測量發光強度，用非線性迴歸計算IC50值。更多細節可在Rothenberger等人的《2022》中找到。·在含有mNeoGreen(MNG)報告基因的臨牀株WA1(2019-nCoV/USA_WA1/2020)的感染性cDNA克隆的遺傳背景上構建了活的棘突嵌合報告病毒(UTMB)，並使用基於PCR的突變方案設計了棘突突變。體外連接、轉錄、電擊入VeroE6細胞，3天后回收突變型病毒。突變病毒與系列稀釋度的ensovibvep在37℃預孵育1h，然後加入預接種的Vero E6-TMPRSS2細胞。感染1h後，取出接種物，用含0.8%甲基纖維素、2%胎牛血清和1%P/S的DMEM覆蓋培養基代換。16h後採集MNG熒光灶的原始圖像，計數病灶數, 用非線性迴歸方法測定IC50。更多細節可以在鄒某等人的《2022》中找到。5 15 20 R.1 A.23.1 B.1.618 Mu/B.1.621 Lambda/C.37 Kappa/B.1.617.1 Iota/B.1.526 Eta/B.1.525 Epsilon/B.1.429奧密克戎。1.529/BA。2奧密克戎/B。1.529/BA。1Delta Plus/AY.1 Delta/B.1.617.2 Gamma/P.1 Beta/B.1.351 Alpha+S494P Alpha+E484K Alpha/B.1.1.7參考10 IC 50(ng/ml)VSV慢病毒正品病毒0 1關注變種(VOC)結果·值得注意的是，對所有測試變種的Ensovibep效力(IC50)保持在1-10 ng/mL的範圍內；與參考/武漢WT病毒(圖3)(Rothenberger等人2022)相差不到一個數量級。圖3.在慢病毒、基於VSV的偽病毒或針對SARS-CoV-2變種和感興趣變種的真實病毒進行的中和試驗中測量的Ensovibep活性。變異替換/缺失R.1 W152L，E484K，D614G，G769V A.23.1 F157L，V367F，Q613H，D614G，P681R B.1.618 del145，del146，E484K，D614G Mu/B.1.621 T95I，Y144S，Y145N，R346K，E484K，N501Y，D614G，P681H，D950N Lambda/C37 G75V，T76I，del246，del247-252，D253N，L452Q，F490S，D614G，T859N Kappa/B.1.617.1 T95I，G142D，E154K，Del246，Del247-252，D253N，L452Q，F490S，D614G，T859N Kappa/B.1.617.1 T95I，G142D，E154K，Del246，del247-252，D253N，L452Q，F490S，D614G，T859N Kappa/B.1.617.1 T95I，G142D，E154K，Del246，del247-252，D253N，L452Q，F490S，D614G，T859N Kappa/B.617.1 T95I，G142D，E154K，Del246，del247-252，D253N，L452Q，F490S，D614L452R、E484Q、D614G、P681R、Q1071H IOTA/B.1.526 L5F、T95I、D253G、E484K、D614G、A701V ETA/B.1.525 Q52R、del69-70、del145、E484K、D614G、Q677H、F888L Epsilon/B.1.429 S13I、P26S、W152C、L452R、D614G奧密克戎/B.1.1.529/BA.2奧密克戎/B.1.51.29/BA.1 T19I、L24-、P25-、P26-26、A27S、B.1.429G142D、V213G、G339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y、Y505H、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、Q954H、N969K A67V、69-70、T95I、G142D、143-145、211、L212I、INS14EPE、G 339、S 371、S 373、S 375 F、K 417 N、NN 440 K、G 446 S、S 477 N、T 478 K、E 484 A、Q 493 R、G 496 S、Q 498 R、N 501 Y、Y 505 H、T 547 K、D 614 G、H 655 Y、N 679 K、P 681 H、N 764 K、D 796 Y、N 856 K、Q 954 H、N 969 K, L 981 F DeltaPlus/AY.1 T19R、T95I、G142D、E156G、del157-158、W258L、K417N、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N Delta/B.1.617.2 T19R、G142D、E156Gl、del157-158、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N伽馬/P.1 L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、1027I、V1176F Beta/B.351 L18F、D80A、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、1027I、V1176F Beta/B.351 L18F、D80A、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、1027I、V1176F/B.351 L18F、D80A、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、1027I、V1176F Beta/B.351 L18F、D80A、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、1027I、V1176F/B.351 L18FD215G、del242-244、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G、A701V Alpha/B.1.1.7+S494P del69-70、del145、S494P、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H Alpha/B.1.1.7+E484K del69-70、del145、E484K、N501Y、A570D、D614G、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H Alpha/B.1.1.7 del69-70、Del145、N501Y、A570D、D14G、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H Alpha/B.1.1.7 del69-70、Del145、N501Y、A570D、D14G、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H Alpha/B.1.1.7 del69-70、Del145、N501Y、A570D、D14GP681H、T716I、S982A、D1118H參考VSV：武漢野生型；慢病毒：D614G；正品：V367F，E990A參考變種是以VSV為基礎的偽病毒的武漢-HU-1株，以慢病毒為基礎的偽病毒的D614G變種，或針對正宗病毒的早期大流行的患者分離株。VSV, 水泡性口炎病毒。·Ensovibep與一組臨牀相關的單抗一起進行了測試(圖4)。圖4.Ensovibep和單抗的中和活性(滴定曲線和IC50)。用野生型和奧密克戎BA.1變異型S蛋白進行VSV假型中和試驗的50條滴定曲線(右圖；平均掃描電子顯微鏡)和IC值(上圖)。Ensovibep與一組經過臨牀驗證的單抗一起進行了測試。該表提供了數值IC50值以及相對於野生型的摺疊變化。野毒型為武漢滬1.120 100 80 60 40 20 0奧密克戎BA.1相對感染率(%)0 10-2 10-1 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 5無病毒濃度(ng/mL)Ensovibep REGN10933 REGN10987 AZD8895 AZD1061 LY-CoV555 LY-CoV016 Brii-196 S 309 120 100 80 60 40 20 0野生型/武漢滬1相對感染(%)0 10-2 10-1 10 0 10 1 10 2 10 3 10 5無病毒濃度(ng/mL)Ensovibep REGN10933 REGN10987 AZD8895 AZD1061 LY-CoV555 LY-CoV016 Brii-196 Brii-198 S 309化合物IC 50(ng/毫升)IC 50(ng/毫升)野生型奧密克戎BA.1對WT Ensovibep 1.6 2.2 1.4 REGN10933 3.2>1000>100 REGN10987 3.3>1000>100 LY-CoV555 13>1000>100 LY-CoV016 6.4>1000>100 S3023 72 3.1 AZD8895 0.6 415>100 AZD1061 5.5 43 237 Brii-196 392 41 Brii-198 30 0.6 IC 50：綠色Ng/ml倍數變為wt：Green：100倍·每個DARPin(R1，R2、R3), 然而，包含所有三個RBD結合域的多特異性ensovibep仍然具有抗BA.1的效力(圖5)。50圖5.個別Ensovibep DARPin模塊對野生型和BA.1野生型奧密克戎BA1的滴定曲線和IC值實體Ensovibep 2.2 2.8 1.3 R1 8.8 359.6 40.7 R2 0.8 5.4 9.9 R3 11.93 496.8 41.6 H Ensovibep的示意圖：H R1 R2 R3 120 100 80 60 40 20 0相對感染(%)0 10-2 10-1 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4無病毒濃度(ng/mL)IC50 2.8 ng/mLIC502.2 ng/mLSARS-CoV-2變異株VSV-偽型中和試驗。Ensovibep IC50 360 ng/mLIC50 8.8 ng/mLR1IC50 5.4 ng/mLIC50 0.8 ng/mLR2 IC50 497 ng/mLIC50 11.9 ng/mLR350 IC(ng/mL)WT 50 IC(ng/mL)該表提供了數值IC50值以及相對於野生型的倍數變化。野毒株為武漢-HU-1。·恩索維貝普保持了對奧密克戎BA的效力。, 從滴定曲線和IC50值可以看出(圖6)。圖6.假病毒中和試驗中的Ensovibep對SARS-CoV-2野生型(武漢-HU-1)和奧密克戎BA2變種的活性。0 20 40 60 80 100 120 10-2 10-1相對感染率(%)0 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4無奧密克戎BA2野生型/參考濃度(ng/mL)(上圖)滴定曲線(上)和IC50值(右)環境蛋白對SARS-CoV-2WT和奧密克戎BA2的毒力保持不變。(右)IC50值和摺疊值變化表。野生型實體IC50(ng/毫升)奧密克戎BA.2 IC50(ng/毫升)倍數變化為WT Ensovibep 2.8 3.3 1.2 Ensovibep下表提供了數值IC50值以及相對於野生型的倍數變化。野生型病毒為武漢-胡-1。圖7。利用活穗嵌合報告病毒對野生型和奧密克戎變異體的Ensovibep活性。Delta/B.1.617.2 T19R，G142D，奧密克戎/B.1.1.529/BA.1 A67V，Del69-70del，S373P，S375F，N501Y，Y505H，N969K，L981F奧密克戎/B.1.1.529/BA.2 T19I，del24-26，R408S，K417N，H655Y，N679K，奧密克戎/B.1.1.529/BA.3 A 67 V，DEL 69-70 D 405 N，K 417 N，D 614 G，H 655 Y，奧密克戎/B.1.1.529/BA.2.12.1T19I，del24-26，R408S，K417N，D614G，H655Y，奧密克戎/B.1.1.529/BA.4/5 c T 19 I，del 24-26 D 405 N，R 408 Y 505 H，D 614 G，IC50值代表2-4個實驗的幾何平均值。B野生型實驗沒有平行進行。C-BA尖峯突變。該表提供了數字(WA-1)DMSO、二甲基亞碸·BA.4和BA.5共享相同的尖峯序列，因此進行了一次實驗來代表這兩種病毒。抗SARS-CoV-2野毒株(WA-1)和奧密克戎BA.2、BA.3、BA.2.12.1、BA.4/5的滴定曲線和IC值, 對除BA.4/5以外的所有變種保持顯示效力的增量變種(圖7)。·奧密克戎變異體的BA.4/5亞系存在F486V突變，減少了RBD結合DARPin結構域的結合，這與先前在偽病毒系統中進行的RBD突變分析的結果一致(圖1)。結論·Ensovibep的中和效力在所有SARS-CoV-2變異株中保持，包括奧密克戎亞系的BA.1、BA.2和BA.2.12.1以及BA.3。·在奧密克戎亞系BA.4/5中觀察到中和效力降低，這可能歸因於該變體中存在的F486V突變。BA.4和BA.5的全球發病率較低(