附件99.1

奥密克戎和Ensovibep的多变量中和活性新冠肺炎：DARP治疗新冠肺炎的候选药物Charles G.Knutson，诺华生物医学研究所，美国马萨诸塞州剑桥市合著者：S.Rothenberger 1，M.Walser 2，F.Malvezzi 2，D.L.Hurdiss 3，J.Mayor 1，H.Moreno 1，S.Ryter 4，N.列支敦士登4，A.Bosshart 2，S.Mangold 2，F.Radom 2，K.Ramanathan 5，O.Enger 4，M.T.Stumpp 21洛桑大学，瑞士洛桑；2分子合作伙伴股份公司，苏黎世-施利耶伦，瑞士；3乌得勒支大学，荷兰乌得勒支；4斯皮兹实验室，瑞士斯皮兹；5诺华制药股份公司，瑞士巴塞尔背景·奥密克戎SARS-CoV-2变种已经改变了新冠肺炎大流行的格局。·奥密克戎的传播率增加，并有能力逃避针对早期变种形成的自然或疫苗诱导的免疫，这有力地提醒人们，病毒进化的力量。·有可能产生多种效果的治疗方法是有效管理大流行的关键组成部分。·ENSOVIBEP是一种一流的抗SARS-CoV-2 DARPin(设计的Ankyrin Repeat Protein)候选治疗药物，它使用三个具有相似对位的不同DARPin结构域(R1、R2、R3)与SARS-CoV-2刺突蛋白三聚体的受体结合域(RBD)的不同区域协同结合，从而阻止与宿主ACE2受体的相互作用。·RBD结合DARPin模块的多特异性结合限制了尖峰蛋白突变对抗病毒效力的影响(图1)。图1。根据GISAID数据库，SARS-CoV-2刺突蛋白点突变的全球频率，包括包含ensovibep、R1、R2、R3的IC50值的热图表格, 所有被测试的点突变。IC50(ng/ml)0-10 11-20 21-50 51-100>100来自VSV/慢病毒检测的RBD数据中的R1R2 R3突变；虚线框：受体结合域的突变。·基于结构数据的描绘，显示RBD结合DARPin结构域(绿色、蓝色、青色)与SARS-CoV-2刺突蛋白三聚体的RBD结合。另外两个DARPin结构域(紫色)与人血清白蛋白(HSA)结合，以提供半衰期延长(图2)。·我们在这里提供的数据支持ensovibep的多变量效力。图2.Ensovibep与SARS-CoV-2刺突蛋白结合。人血清白蛋白；RBD，受体结合域。方法以缺失糖蛋白基因(G)的重组VSV*Delg-Luc载体为基础，构建VSV伪型病毒系统(CHUV)，并用绿色荧光蛋白和荧光素酶基因进行替换。野生型穗粒基于武汉-沪1号序列。将假病毒与Ensovibep的系列稀释液混合，在37℃预孵育90min，然后加入预接种的VeroE6细胞。孵育90min后，去掉接种物，加入新鲜培养液，继续孵育16h，根据One-Glo-Ift荧光素酶检测系统裂解细胞。测量相对光单位，用非线性回归计算IC50值。更多细节可在Rothenberger等人的《2022》中找到。·通过共转染pCMVDELR8.2，在293T细胞中产生了携带刺突蛋白和萤火虫荧光素酶报告基因的慢病毒假病毒(Activ/FDA), Phr‘CMVLuc和pCDNA3.1(+)-尖峰突变体。野生型穗粒基于武汉-沪1号序列。假病毒与连续稀释的Ensovibep在37℃预孵育2 h，然后加入预先接种的293T-ACE2.TMPRSS2s细胞。48h后通过检测荧光素酶活性对假病毒感染进行评分，并用非线性回归计算IC50。更多细节可以在Neerukonda等人的《2021》中找到。·活的正宗病毒检测(Spiez实验室)：野生型病毒为法国分离株，与武汉-HU-1病毒相比有以下变化：V367F，E990A。连续稀释的Ensovibep与100个TCID 50 SARS-CoV-2变异体在37℃预孵育1h，然后加入预种的VeroE6-TMPRSS2细胞。培养3d后，用CellTiter-Glo法检测细胞存活率。测量发光强度，用非线性回归计算IC50值。更多细节可在Rothenberger等人的《2022》中找到。·在含有mNeoGreen(MNG)报告基因的临床株WA1(2019-nCoV/USA_WA1/2020)的感染性cDNA克隆的遗传背景上构建了活的棘突嵌合报告病毒(UTMB)，并使用基于PCR的突变方案设计了棘突突变。体外连接、转录、电击入VeroE6细胞，3天后回收突变型病毒。突变病毒与系列稀释度的ensovibvep在37℃预孵育1h，然后加入预接种的Vero E6-TMPRSS2细胞。感染1h后，取出接种物，用含0.8%甲基纤维素、2%胎牛血清和1%P/S的DMEM覆盖培养基代换。16h后采集MNG荧光灶的原始图像，计数病灶数, 用非线性回归方法测定IC50。更多细节可以在邹某等人的《2022》中找到。5 15 20 R.1 A.23.1 B.1.618 Mu/B.1.621 Lambda/C.37 Kappa/B.1.617.1 Iota/B.1.526 Eta/B.1.525 Epsilon/B.1.429奥密克戎。1.529/BA。2奥密克戎/B。1.529/BA。1Delta Plus/AY.1 Delta/B.1.617.2 Gamma/P.1 Beta/B.1.351 Alpha+S494P Alpha+E484K Alpha/B.1.1.7参考10 IC 50(ng/ml)VSV慢病毒正品病毒0 1关注变种(VOC)结果·值得注意的是，对所有测试变种的Ensovibep效力(IC50)保持在1-10 ng/mL的范围内；与参考/武汉WT病毒(图3)(Rothenberger等人2022)相差不到一个数量级。图3.在慢病毒、基于VSV的伪病毒或针对SARS-CoV-2变种和感兴趣变种的真实病毒进行的中和试验中测量的Ensovibep活性。变异替换/缺失R.1 W152L，E484K，D614G，G769V A.23.1 F157L，V367F，Q613H，D614G，P681R B.1.618 del145，del146，E484K，D614G Mu/B.1.621 T95I，Y144S，Y145N，R346K，E484K，N501Y，D614G，P681H，D950N Lambda/C37 G75V，T76I，del246，del247-252，D253N，L452Q，F490S，D614G，T859N Kappa/B.1.617.1 T95I，G142D，E154K，Del246，Del247-252，D253N，L452Q，F490S，D614G，T859N Kappa/B.1.617.1 T95I，G142D，E154K，Del246，del247-252，D253N，L452Q，F490S，D614G，T859N Kappa/B.1.617.1 T95I，G142D，E154K，Del246，del247-252，D253N，L452Q，F490S，D614G，T859N Kappa/B.617.1 T95I，G142D，E154K，Del246，del247-252，D253N，L452Q，F490S，D614L452R、E484Q、D614G、P681R、Q1071H IOTA/B.1.526 L5F、T95I、D253G、E484K、D614G、A701V ETA/B.1.525 Q52R、del69-70、del145、E484K、D614G、Q677H、F888L Epsilon/B.1.429 S13I、P26S、W152C、L452R、D614G奥密克戎/B.1.1.529/BA.2奥密克戎/B.1.51.29/BA.1 T19I、L24-、P25-、P26-26、A27S、B.1.429G142D、V213G、G339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y、Y505H、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、Q954H、N969K A67V、69-70、T95I、G142D、143-145、211、L212I、INS14EPE、G 339、S 371、S 373、S 375 F、K 417 N、NN 440 K、G 446 S、S 477 N、T 478 K、E 484 A、Q 493 R、G 496 S、Q 498 R、N 501 Y、Y 505 H、T 547 K、D 614 G、H 655 Y、N 679 K、P 681 H、N 764 K、D 796 Y、N 856 K、Q 954 H、N 969 K, L 981 F DeltaPlus/AY.1 T19R、T95I、G142D、E156G、del157-158、W258L、K417N、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N Delta/B.1.617.2 T19R、G142D、E156Gl、del157-158、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N伽马/P.1 L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、1027I、V1176F Beta/B.351 L18F、D80A、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、1027I、V1176F Beta/B.351 L18F、D80A、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、1027I、V1176F/B.351 L18F、D80A、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、1027I、V1176F Beta/B.351 L18F、D80A、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、1027I、V1176F/B.351 L18FD215G、del242-244、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G、A701V Alpha/B.1.1.7+S494P del69-70、del145、S494P、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H Alpha/B.1.1.7+E484K del69-70、del145、E484K、N501Y、A570D、D614G、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H Alpha/B.1.1.7 del69-70、Del145、N501Y、A570D、D14G、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H Alpha/B.1.1.7 del69-70、Del145、N501Y、A570D、D14G、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H Alpha/B.1.1.7 del69-70、Del145、N501Y、A570D、D14GP681H、T716I、S982A、D1118H参考VSV：武汉野生型；慢病毒：D614G；正品：V367F，E990A参考变种是以VSV为基础的伪病毒的武汉-HU-1株，以慢病毒为基础的伪病毒的D614G变种，或针对正宗病毒的早期大流行的患者分离株。VSV, 水泡性口炎病毒。·Ensovibep与一组临床相关的单抗一起进行了测试(图4)。图4.Ensovibep和单抗的中和活性(滴定曲线和IC50)。用野生型和奥密克戎BA.1变异型S蛋白进行VSV假型中和试验的50条滴定曲线(右图；平均扫描电子显微镜)和IC值(上图)。Ensovibep与一组经过临床验证的单抗一起进行了测试。该表提供了数值IC50值以及相对于野生型的折叠变化。野毒型为武汉沪1.120 100 80 60 40 20 0奥密克戎BA.1相对感染率(%)0 10-2 10-1 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 5无病毒浓度(ng/mL)Ensovibep REGN10933 REGN10987 AZD8895 AZD1061 LY-CoV555 LY-CoV016 Brii-196 S 309 120 100 80 60 40 20 0野生型/武汉沪1相对感染(%)0 10-2 10-1 10 0 10 1 10 2 10 3 10 5无病毒浓度(ng/mL)Ensovibep REGN10933 REGN10987 AZD8895 AZD1061 LY-CoV555 LY-CoV016 Brii-196 Brii-198 S 309化合物IC 50(ng/毫升)IC 50(ng/毫升)野生型奥密克戎BA.1对WT Ensovibep 1.6 2.2 1.4 REGN10933 3.2>1000>100 REGN10987 3.3>1000>100 LY-CoV555 13>1000>100 LY-CoV016 6.4>1000>100 S3023 72 3.1 AZD8895 0.6 415>100 AZD1061 5.5 43 237 Brii-196 392 41 Brii-198 30 0.6 IC 50：绿色Ng/ml倍数变为wt：Green：100倍·每个DARPin(R1，R2、R3), 然而，包含所有三个RBD结合域的多特异性ensovibep仍然具有抗BA.1的效力(图5)。50图5.个别Ensovibep DARPin模块对野生型和BA.1野生型奥密克戎BA1的滴定曲线和IC值实体Ensovibep 2.2 2.8 1.3 R1 8.8 359.6 40.7 R2 0.8 5.4 9.9 R3 11.93 496.8 41.6 H Ensovibep的示意图：H R1 R2 R3 120 100 80 60 40 20 0相对感染(%)0 10-2 10-1 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4无病毒浓度(ng/mL)IC50 2.8 ng/mLIC502.2 ng/mLSARS-CoV-2变异株VSV-伪型中和试验。Ensovibep IC50 360 ng/mLIC50 8.8 ng/mLR1IC50 5.4 ng/mLIC50 0.8 ng/mLR2 IC50 497 ng/mLIC50 11.9 ng/mLR350 IC(ng/mL)WT 50 IC(ng/mL)该表提供了数值IC50值以及相对于野生型的倍数变化。野毒株为武汉-HU-1。·恩索维贝普保持了对奥密克戎BA的效力。, 从滴定曲线和IC50值可以看出(图6)。图6.假病毒中和试验中的Ensovibep对SARS-CoV-2野生型(武汉-HU-1)和奥密克戎BA2变种的活性。0 20 40 60 80 100 120 10-2 10-1相对感染率(%)0 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4无奥密克戎BA2野生型/参考浓度(ng/mL)(上图)滴定曲线(上)和IC50值(右)环境蛋白对SARS-CoV-2WT和奥密克戎BA2的毒力保持不变。(右)IC50值和折叠值变化表。野生型实体IC50(ng/毫升)奥密克戎BA.2 IC50(ng/毫升)倍数变化为WT Ensovibep 2.8 3.3 1.2 Ensovibep下表提供了数值IC50值以及相对于野生型的倍数变化。野生型病毒为武汉-胡-1。图7。利用活穗嵌合报告病毒对野生型和奥密克戎变异体的Ensovibep活性。Delta/B.1.617.2 T19R，G142D，奥密克戎/B.1.1.529/BA.1 A67V，Del69-70del，S373P，S375F，N501Y，Y505H，N969K，L981F奥密克戎/B.1.1.529/BA.2 T19I，del24-26，R408S，K417N，H655Y，N679K，奥密克戎/B.1.1.529/BA.3 A 67 V，DEL 69-70 D 405 N，K 417 N，D 614 G，H 655 Y，奥密克戎/B.1.1.529/BA.2.12.1T19I，del24-26，R408S，K417N，D614G，H655Y，奥密克戎/B.1.1.529/BA.4/5 c T 19 I，del 24-26 D 405 N，R 408 Y 505 H，D 614 G，IC50值代表2-4个实验的几何平均值。B野生型实验没有平行进行。C-BA尖峰突变。该表提供了数字(WA-1)DMSO、二甲基亚砜·BA.4和BA.5共享相同的尖峰序列，因此进行了一次实验来代表这两种病毒。抗SARS-CoV-2野毒株(WA-1)和奥密克戎BA.2、BA.3、BA.2.12.1、BA.4/5的滴定曲线和IC值, 对除BA.4/5以外的所有变种保持显示效力的增量变种(图7)。·奥密克戎变异体的BA.4/5亚系存在F486V突变，减少了RBD结合DARPin结构域的结合，这与先前在伪病毒系统中进行的RBD突变分析的结果一致(图1)。结论·Ensovibep的中和效力在所有SARS-CoV-2变异株中保持，包括奥密克戎亚系的BA.1、BA.2和BA.2.12.1以及BA.3。·在奥密克戎亚系BA.4/5中观察到中和效力降低，这可能归因于该变体中存在的F486V突变。BA.4和BA.5的全球发病率较低(