附件10.1

研究服务协议

本研究服务协议(“协议”)于2022年2月4日(“生效日期”)签订，由特拉华州的Ampio制药公司和科罗拉多州的有限责任公司创伤性研究有限责任公司签订，前者的地址是科罗拉多州恩格尔伍德80112号因弗内斯公园大道373号，后者的地址是80110号东牛津巷900号(以下简称“承包商”)。业主和承包商在本文中可单独称为“一方”，并统称为“双方”。

1.服务的接洽。双方可以签订一个或多个研究项目分配(其形式作为本协议的附件A)(每个已执行的研究项目分配，一份“研究项目分配”)。一旦执行，每个研究项目转让将对各方具有约束力，并并入本协议。承包商应在每个研究项目任务中规定的完成日期前提供研究服务(下称“服务”)。

2.补偿。在期限内，公司将向承包商支付每个研究项目转让中规定的费用，用于根据本协议提供的服务和任何此类研究项目转让(“承包商服务费”)。承包商只有在收到承包商发票后三十(15)天内，才能报销研究项目分配中明确规定的费用或公司事先书面批准的费用，前提是承包商提供了公司可能合理要求的授权费用的文件。除承包商未纠正的违反本协议以外的任何原因终止本协议时，承包商将仅根据研究项目分配中所述的在终止前已及时和适当完成的工作的基础向承包商支付服务费。如果由于承包商违反本协议而终止本协议，承包商将有权不再从公司获得任何进一步的付款。

3.研究项目。

3.1服务将在David Bar博士或(“首席调查员”)的指导下进行，并将在承包商选择的一个或多个其他合适的设施进行。首席调查员应适当地监督所有提供与服务有关的服务的人员，并应确保他们遵守本协议的条款和研究项目任务中确定的任何要求。

3.2业主与首席调查员进行协商和沟通的指定代表应为Mike Martino或业主不时以书面形式指定给承包商和首席调查员的其他人员。

3.3在任期内，公司代表可亲自或通过电话与首席调查员和其他承包商代表就服务进行非正式磋商。承包商在咨询过程中进行的工作应在首席调查员的合理控制下进行，但应在合理的基础上对工作进行观察。

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3.4首席调查员应公司指定代表的要求，在任期内每年提交最多四份口头报告。在本协议终止后九十(90)天内，首席调查员应编写一份最终报告，总结通过履行服务所开展的所有活动和取得的成就。

4.唱片。承包商应保存与服务直接相关的准确财务和科学记录，这些记录应全面、恰当地反映在服务执行中完成的所有工作和取得的结果(包括适用法律和法规要求的所有数据)，并应在协议终止后的整个期限内和一年内向公司或其授权代表提供此类记录，或在合理通知后，在正常营业时间内法律要求的较长时间内提供此类记录。在销毁或以其他方式处置任何此类记录之前，承包商应向公司提供合理的机会，让公司自费拥有这些记录。

5.独立承包商关系。双方在本合同项下的关系是独立承包人的关系。本协议的任何内容都不打算、也不应被解释为在双方之间建立伙伴关系、代理关系、合资企业关系或雇佣关系。承包商应控制履行本协议项下承包商义务的方式和方法，包括保留代表承包商行事的第三方，例如瑞典部门、瑞典实验室和圣安东尼部门的工作人员(“承包商代理人”)，但前提是承包商应促使承包商代理人遵守本协议第6节的规定，承包商应对承包商代理人的表现负责。承包商将无权享受公司可能向其员工提供的任何福利，包括但不限于团体健康或人寿保险、利润分享或退休福利。承包商无权代表公司作出任何陈述、合同或承诺，除非公司经理以书面形式明确要求或授权这样做。承包商单独负责并将及时提交与履行本协议项下的服务和收取本协议项下的费用有关的所有需要向任何联邦、州或地方税务机关提交或支付的纳税申报单和付款。承包商单独负责并必须充分记录在履行本协议项下的服务过程中发生的费用。承包商补偿的任何部分将不会被公司扣留，用于支付任何社会保障税、联邦税、州税或任何其他员工工资税。在公司办公场所内或使用公司设备时，承包商应遵守公司有关商业和办公室行为的所有适用政策, 健康和安全，以及使用公司的设施、用品、信息技术、设备、网络和其他资源。

6.机密信息。

6.1保密信息的定义。本协议中所指的任何和所有技术和非技术信息，包括专利、版权、商业秘密和专有信息、技术、草图、图纸、模型、发明、专有技术、工艺、设备、设备、算法、软件程序、软件源文件和公式，与公司、其供应商和客户当前、未来和拟议的产品和服务有关，包括但不限于公司各自的研究、试验工作、开发、设计细节和规格、工程、财务信息、采购要求、采购、

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制造、客户名单、业务预测、销售和销售以及营销计划和信息。服务执行的所有数据或结果应为保密信息，并由公司独家拥有。保密信息还包括任何第三方的专有或保密信息，这些第三方在开展公司的业务或履行本协议项下的各自服务时可能向公司或承包商披露此类信息。

6.2保密义务和不使用义务。承包商仅将保密信息用于履行服务规定的义务，仅为公司的利益服务。承包商同意，其对待所有机密信息的谨慎程度与对待其自身机密信息的程度相同，但在任何情况下都应采取不低于合理谨慎的态度。承包商同意，其只能向需要了解机密信息以执行研究项目任务的员工以及先前同意遵守与本协议基本相似的条款和条件的员工披露机密信息，无论是作为雇用条件还是为了获取机密信息。任何未经授权使用或披露保密信息的行为，承包商应立即通知业主。承包商同意协助公司纠正任何此类未经授权使用或披露保密信息的行为。在提供本合同项下的服务时，如果承包商希望向第三方披露保密信息，承包商必须事先征得公司的书面同意，并向公司提供一份已签署的保密协议副本，以约束该第三方遵守至少与第6条中包含的保密条款同样严格的条款。

6.3不履行保密义务和不使用义务。当承包商能够证明：(A)在业主向承包商传达信息时或之后，机密信息在业主传达给承包商时或之后处于公共领域；(B)在业主向承包商传达时或之后，承包商合法地拥有机密信息而不承担任何保密义务；(C)承包商的雇员或代理人独立于业主传达给承包商的任何信息而开发的；(C)承包商的雇员或代理人开发的保密信息应终止。

6.4授权披露。本协议不应限制承包商在适用法律要求的范围内或任何司法、监管、执法或政府机构要求的范围内披露保密信息，但承包商应在法律允许的范围内向公司发出关于该要求或请求的通知，以便公司可以寻求(由公司承担费用)保护令或其他适当的救济。

6.5第三方信息的披露。任何一方不得向另一方传达任何信息，侵犯任何第三方的专有权利。

6.6出版和学术权利。未经业主事先书面同意，承包商不得就本协议或本协议细节的存在发布任何新闻稿或进行任何公开演示或公告；但此类限制不适用于承包商组织内或法律要求的披露或报告。任何一方不得使用对方的名称或其高级管理人员、董事、

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或员工未经另一方事先书面同意，擅自在任何广告、销售、促销或宣传材料中使用。服务的结果可以在科学文献中发表，也可以用于提交给监管机构。双方的意图是，公司和首席调查员将共同发布或展示服务的结果，除非事先获得公司的具体许可，承包商可以单独发布结果。对于承包商发布的单独结果，承包商必须在提交前三十(30)天向公司提供一份供发布或演示的材料副本，以便公司可以：(A)审查此类材料的背景信息的准确性，(B)确定此类发布不会损害公司正在进行的专利权或任何机密信息，以及(C)采取必要行动保护公司专利权。

7.公司财产的所有权。

7.1公司是公司财产的唯一和独家所有人。“公司财产”是指(A)由公司向承包商提供的、承包商在为公司或与公司合作的生效日期之前生产的、或在生效日期之后由承包商在履行本协议时或根据任何研究项目任务生产的所有材料(包括但不限于所有文件、数据、报告、图纸、分析、设备、产品、原型、服务和其他工作)；以及(B)在生效日期之前或之后产生的所有版权、专利、商业秘密、发明和其他专有或知识产权。承包商履行本协议或根据任何研究项目任务或履行任何服务。“公司财产”一词不包括承包商在履行服务之前获得的任何一般知识、方法、流程、产品、设备或经验，也不包括从无关来源获得的与履行服务平行的经验。在法律允许的最大范围内，公司在生效日期之前或之后生产的所有财产应被视为为公司利益而出租的作品，正如美国联邦和国际版权法对该术语的定义。在公司财产可能不被视为出租工程的范围内，承包商在此不可撤销地无条件地将其在公司财产中的所有权利、所有权和权益出售、转让和转让给公司，而无需额外的对价。承包商应迅速签署并交付业主合理要求的所有文件和文书，以证明此类转让，承包商应获得为履行本义务而产生的合理费用的补偿。此外，承包商在此以不可撤销的方式放弃并放弃任何不可转让的权利，包括任何“道德”权利, 该承包商或其任何雇员、管理人员或代理人可能拥有公司的任何财产。

7.2承包商无条件地向公司授予非独家的、永久的、不可撤销的、全球范围内的、全额支付的权利和许可，有权通过多个级别的从属被许可人，根据任何用于或并入公司财产或以其他方式开发公司财产所必需的承包商的任何版权、专利、商业秘密、发明和其他知识产权或专有权利，进行再许可：(A)以任何媒介或格式复制、创作衍生作品、分发、公开表演、公开展示、传播和以其他方式使用公司财产，无论是现在已知的还是以后发现的，(B)使用、制造、制造、出售、要约出售、进口、及(C)不受限制地行使本公司财产的任何及所有其他现有或未来权利。

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7.3承包者声明并保证其雇员、代理人(包括首席调查员)和为承包者或与承包者相关的任何其他服务人员有合同义务将公司财产的所有权利、所有权和利益传达给公司，并且承包商允许访问机密信息或公司财产的所有第三方将签订保密、保密和发明转让协议，其条款至少与本协议中的条款一样保护机密信息和公司财产。

8.返还公司财产。承包商同意应公司的要求，在任何时候及时向公司交付公司财产的原件和任何副本。当任何一方因任何原因终止本协议时，承包商同意立即向公司交付或由公司选择销毁公司财产的原件和任何副本。如果公司提出要求，承包商同意书面证明承包商已退还或销毁所有此类公司财产。

9.材料转移。

9.1预计在服务过程中，公司将向承包商提供各种化学和生物材料，包括但不限于化合物、细胞系、组织和流体样本，以及由公司拥有或专有(或由获得该等材料的第三方专有)的相关技术和数据(“公司材料”)。公司应提供公司所需的任何材料。根据双方签订的单独材料转让协议履行服务。业主有权自行决定将公司提供给承包商的材料分发给其他人，并将其用于自己的目的。

9.2未经公司事先书面同意，首席调查员应仅将公司材料用于与服务有关的用途，不得将其用于任何其他目的，事先书面同意不得无理拒绝。承包商不得向首席调查员直接监督下的实验室人员以外的任何个人或实体分发、发布或以任何方式披露公司材料。除研究项目分配明确规定外，承包商不得对任何公司材料进行反向工程、反编译、解码、拆解或以其他方式尝试确定特定配方或成分。

9.3承包商应确保，除非获得公司书面许可，否则任何人不得将公司材料带到或发送到任何其他地点。公司材料由承包商和公司提供，仅用于实验室动物或体外实验的研究用途。公司材料、任何经其处理或从中衍生的化学或生物材料均不得用于人体。

9.4本协议和由此产生的公司材料转让构成仅将公司材料用于服务目的的许可。除本协议另有规定外，接受方同意，根据本第9条的规定，不应被视为授予任何专利下的任何权利。应业主的要求，承包商应归还所有未使用的业主材料，无论是否在合同期限内。

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9.5公司提供的任何材料都是试验性的，不应对适销性或特定用途的适用性或任何其他明示或默示的保证作出保证。对于使用公司材料不会侵犯任何专利或其他专有权，不作任何陈述或保证。

9.6在任何情况下，公司对承包商使用公司材料，或因本协议或公司材料的使用、搬运或储存而引起或与之相关的任何种类或性质的损失、索赔、损害或责任概不负责。

9.7承包商应按照适用于公司材料的所有法律、政府法规和指导方针使用公司材料。

10.

任期和解约期。

10.1学期。本协议自上文规定的生效日期起生效，并将一直持续到下述规定的终止(下称“条款”)为止。

10.2由公司终止。业主可在提前九十(90)天书面通知承包商后，随时终止本协议，无论是否有理由。

10.3承包商终止合同。承包商可在提前九十(90)天书面通知业主后，随时终止本协议，不论是否有任何理由。

10.4生存。第4、5、6、7、9.5、10、11、13和17-23节在本协议终止或到期后继续有效。

11.通知。一方被要求或被允许向另一方发出的任何通知，应以亲自递送或挂号信、要求的回执、按下文第11条规定的适当地址或另一方不时以书面指定的其他地址寄给另一方的方式发出。任何这类通知的面交日期或邮寄日期应被视为其交付日期。

IFO公司：	因弗内斯公园大道373号，套房200
	安格尔伍德，科罗拉多州80112
	收信人：首席执行官迈克尔·A·马蒂诺
如果给承包商：	牛津东街900号
	安格尔伍德，科罗拉多州80110
	收信人：大卫·巴尔博士

12.

回复12投诉和担保。

12.1质量。承包商声明并向业主保证，根据本协议执行的服务应以当前良好且健全的专业程序和做法所要求的技能和谨慎程度进行，并符合执行工作时普遍接受的专业标准，以便

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确保所提供的服务符合本协议和相关研究项目任务中预期的目的。

12.2合规性。承包商声明并向公司保证，在履行服务的过程中以及与本合同项下的所有活动相关的情况下，承包商将遵守适用的法律、规则、法规、指导方针和普遍接受的标准，包括但不限于美国食品和药物管理局(FDA)的法规，并且承包商过去、将来、将来都不会以任何身份使用根据1992年《仿制药执法法》或任何其他相当于后续法规、规则或法规的FDA禁止或取消资格的人员的服务。承包商同意，如果承包商或任何此类人员已被取消资格或取消资格，或已就取消资格或取消资格提起诉讼，则无论此类取消资格或程序是否发生在服务执行期间或之后，承包商均应立即书面通知业主。业主有权在收到承包商的通知后终止本协议，该通知称承包商收到了关于解除禁令的诉讼通知或诉讼威胁，或根据本条款第12.2条的规定被禁止。此外，承包人同意在合同期限内始终遵守《Ampio PharmPharmticals，Inc.商业行为和道德准则》和《Ampio PharmPharmticals，Inc.内幕交易政策》，其中一份作为附件B，另一份作为附件C。

12.3将军。承包商向业主表示并保证：(A)承包商有权订立本协议，授予本协议中授予的权利，并充分履行本协议中承包商的所有义务；(B)承包商与公司订立本协议，承包商履行服务，不会也不会与承包商受其约束的任何其他协议项下的任何违约或违约发生冲突或导致违约；(C)公司将获得对公司所有财产的良好和有效的所有权，没有任何类型的产权负担和留置权；和(D)承包商有权约束瑞典和圣安东尼，控制瑞典部门、瑞典实验室和圣安东尼部门的活动，并且该承包商与瑞典和圣安东尼签订了与本协议不相抵触的协议。

12.4侵犯知识产权。承包商向公司表示，根据本合同提供、生产或执行的材料、产品、服务或其他工作任务不会侵犯任何个人或实体的版权、专利、商业秘密或许可证，或以其他方式侵犯其知识产权或专有权利。承包商同意赔偿、辩护并使公司及其高级管理人员、董事、员工和代理人免受因任何此类侵权(无论承包商是否知道)以及针对公司提起的任何诉讼、要求或索赔而产生的任何和所有责任、成本和损害。承包商还同意支付因此类诉讼、要求或索赔而产生的任何判决或合理的和解提议，并支付所有损害赔偿和律师费。如果存在此类索赔，承包商同意为公司采购继续使用该材料的权利，将其替换为非侵权材料，或将其修改为非侵权材料。

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13.赔偿。

13.1按公司。业主同意赔偿、辩护承包商及其受托人、董事、高级管理人员、雇员、代理人和承包商(合称“承包商受赔方”)因第三方索赔、要求、成本或判决而遭受的责任和损失(包括合理的律师费和费用)，并使其免受最终判给或最终支付的损害赔偿，只要此类损失源于：(I)承包商根据研究项目任务、公司指示和适用法律使用公司材料直接造成的第三方人身伤害；(Ii)任何公司受赔人(定义见下文)的疏忽、鲁莽或故意不当行为；或(Iii)公司严重违反本协议。业主的赔偿义务不适用于承包商根据下文第13.2条可赔偿的任何损失。

13.2由承包商提供。承包商同意赔偿、捍卫公司及其股东、董事、高级管理人员、雇员、代理人和承包商(“公司受赔方”)遭受的第三方损失，并使其不受损害，只要此类损失是由于以下原因引起的：(I)任何承包商受赔方未能遵守研究项目任务、本协议条款或适用法律；(Ii)任何承包商受赔方的疏忽、鲁莽或故意不当行为；或(Iii)承包商实质性违反本协议。

14.保险。公司应自费为其高级管理人员、董事、雇员和代理人的行为和不作为维持业务和一般责任，包括但不限于因其赞助服务而可能产生的索赔、责任、损害和判决。所有此类保险的发放形式和金额应符合卫生保健行业的合理和惯例。应要求，应向承包商提供此保险范围的书面文件。

15.利益冲突。承包商应采取合理的谨慎和努力，防止任何可能导致与公司任何利益冲突的行为或条件。在合同期限内，承包商不得接受任何与公司产生利益冲突或以任何方式影响本协议项下提供的服务的雇佣或咨询工作。业主理解承包商单独或与其他研究人员一起参与代表其他赞助商进行的研究。

16.弃权。任何一方未能坚持要求另一方严格遵守本协议的任何条款、契约或条件，不应被视为放弃该条款、契约或条件，也不应被视为在任何时间或任何其他时间放弃或放弃任何权利或权力。

17.治国理政。本协议受科罗拉多州法律管辖。

18.任务。本协议可由公司就收购(以任何方式)转让，包括通过与另一家公司合并或将其几乎所有相关业务出售给另一家公司。本协议只能由业主在征得承包商同意的情况下转让，不得无理扣留。未经业主事先书面同意，承包商不得转让服务或本协议的任何部分。

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19.整个协议。本协议构成双方之间与本主题有关的全部协议，并取代关于该主题的所有先前或同时的口头或书面协议。本协议的条款将适用于承包商为公司承担的所有研究项目任务和服务。经双方授权代表书面同意后，方可更改本协议。

20.2016年《保护商业秘密法》。承包商确认已收到《美国法典》第18编第1833(6)(1)条规定的下列通知：“根据任何联邦或州商业秘密法，个人不应因以下情况而承担刑事或民事责任：(A)以保密方式向联邦、州或地方政府官员直接或间接或向律师披露商业秘密；以及(Ii)仅出于举报或调查涉嫌违法的目的；或(B)在诉讼或其他程序中提起的申诉或其他文件中，如果此类备案是密封的。”

21.非恳求。双方同意，在本协议终止或期满后的十二(12)个月内，除非为另一方的利益或经另一方事先书面同意，否则不会以任何方式直接或间接地终止与另一方或其任何附属公司或子公司的关系，不论原因为何(“限制期”)：(A)提出雇用、诱使或试图诱使另一方或其任何附属公司或子公司的任何高级职员、雇员或代理人终止其与另一方或其任何附属公司或子公司的关系；(B)直接或间接招揽或试图招揽另一方的任何雇员；或(C)(I)召唤、招揽、转移或带走另一方或其任何供应商的任何客户、企业或潜在客户，及/或(Ii)以任何理由招揽、引诱或试图说服另一方的任何其他顾问离开另一方的服务。为免生疑问，第21条的任何规定都不限制或禁止一方拥有和公布现有职位空缺，或面试和雇用另一方的人员，只要他们不是直接征求和/或回应一方提供的一般职位空缺。如果与限制的地域或实质性范围或限制的期限有关的规定超过了法院或主管管辖权将强制执行的最大区域或期限，当事各方同意，这些区域和期限应被视为具有管辖权的法院将在应召集此类法院的任何国家强制执行的最大区域或期限。

22.不显示分辨率(_U)。

22.1除以下规定外，双方之间因本协议引起或与本协议有关的任何争议，或本协议的违反、终止或有效性，应通过具有约束力的仲裁来最终解决，仲裁应根据J.A.M.S./Endispute综合仲裁规则和程序迅速进行。仲裁应受《美国仲裁法》第9编第16节管辖，对仲裁员所作裁决的判决可由任何有管辖权的法院作出。仲裁地点为科罗拉多州丹佛市。

22.2仲裁应在本合同任何一方提出书面仲裁请求之日起60天内开始。关于仲裁程序，仲裁员有权命令每一方当事人和任何第三方证人出示文件。此外，每一方当事人都有权进行最多三次书面陈述，

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仲裁员可酌情在移动一方提出好的理由的情况下允许补充证词。但是，仲裁员无权命令回答质询或对接纳请求作出答复。关于任何仲裁，仲裁当事各方应不迟于仲裁日期前七个工作日向另一方提供可在仲裁中作证的所有人员的身份，以及一方当事人的证人或专家可能提出或考虑或使用的所有文件的副本。仲裁员的决定和裁决应在选定仲裁员后六个月内作出和作出。仲裁员的决定应为任何损害赔偿裁决或赔偿责任裁决提供合理的依据。仲裁员无权判给超过实际补偿性赔偿金的损害赔偿金，不得增加实际赔偿金或判给惩罚性赔偿金，双方特此不可撤销地放弃对此类损害赔偿的任何索赔。

22.3每一方都约定并同意该方将本着善意参加仲裁。第22条同样适用于临时、初步或永久禁令救济的请求，但在临时或初步禁令救济的情况下，任何一方都可以出于避免直接和不可弥补的损害的有限目的而在法庭上进行诉讼，而无需事先进行仲裁。

22.4每一方(A)在此不可撤销地接受任何有管辖权的美国地方法院的司法管辖，以便在任何此类诉讼中执行裁决或决定，(B)在任何此类诉讼、诉讼或程序中，放弃并同意不以动议或其他方式作为抗辩或其他方式主张在任何此类诉讼、诉讼或程序中声称其本人不受上述法院管辖、其财产豁免或免于扣押或执行(受适用法律保护的除外)、该诉讼、诉讼或诉讼是在不方便的法院提起的、诉讼的地点、诉讼或程序不适当，或本协议或本协议的标的物不得在该法院或由该法院强制执行，并且(C)特此放弃并同意不寻求任何其他司法管辖权法院的任何复审，该法院可能被要求强制执行任何该法院的判决。缔约双方特此同意将法律程序文件以挂号邮递方式送达，送达地址应为发出通知的地址。每一方同意其服从管辖权并同意以邮寄方式送达法律程序文件是为了另一方的明示利益。在任何该等诉讼、诉讼或法律程序中，任何一方败诉的最终判决，可在其他司法管辖区借就判决而提出的诉讼、诉讼或法律程序强制执行，或以该其他司法管辖区的法律所规定或依据的任何其他方式强制执行。

23.对应者。本协议可以一式两份签署。

[签名页如下]

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双方自生效之日起已签署本协议，特此为证。

公司：		承包商：

Ampio制药公司		创伤研究有限责任公司


由以下人员提供：	迈克尔·A·马蒂诺	由以下人员提供：
姓名：	迈克尔·A·马蒂诺	姓名：	大卫·巴尔-或者
标题：	董事长兼首席执行官

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附件A

研究项目作业

本研究项目转让(以下简称“研究项目转让”)是Ampio制药公司(下称“公司”)与创伤研究有限责任公司(下称“承包商”)之间于2022年2月4日签订的特定研究服务协议(以下简称“协议”)的后续协议，自2022年2月4日(“研究项目转让生效日期”)起生效。这项研究项目任务受协议条款的约束。本研究项目作业中任何与该协议不一致的项目均无效。

Ampio制药公司和TR LLC研究合作：

研究计划计划

大卫·巴尔，医学博士，梅丽莎·A·豪斯堡，博士，杰森·S·威廉姆斯，博士

Ampio FTE：格雷戈里·W·托马斯，拉斐尔·巴尔-或，克里斯汀·赫特，MS

执行摘要

离体将进行研究使用Ampion(AR-100和AR-300)研究1)软骨形成，以支持疾病改善骨关节炎药物(DMOAD)的应用；2)炎症组的作用机制，以支持骨关节炎(OA)以外的靶向适应症和开发应用。这些目标将得到A的支持)体外工作；B)RNA(转录组学)、蛋白质(蛋白质组学)和代谢物(代谢组学)；c)生物信息学，旨在提供支持有效过渡到临床开发的临床前研究计划。

安培恩已被临床证明可以减轻疼痛，早期研究支持推迟膝骨关节炎(OAK)患者的全膝关节置换术。离体支持这一假设的研究安培恩促进软骨生成和软骨修复将支持安培恩程序。


执行摘要	12

1.AMPION对软骨细胞生物学影响的研究	16

背景	16

目标	16

材料与方法	16

预算和时间表	23

2.AMPION对炎症体抑制作用的研究	24

背景	24

目标	24

材料与方法	24

预算和时间表	25

3.蛋白质组学与代谢组学分析	27

背景	27

目标	27

材料与方法	27

预算和时间表	29

4.BIOINFORMATICS	31

背景	31

目标	32

资源与材料	33

方法论	34

预算和时间表	35

5.BUDGET摘要	36

6.BUDGET审批	37

1.Ampion对软骨细胞生物学影响的研究

背景

骨关节炎的病理包括一系列复杂的细胞事件，导致软骨逐渐丧失、滑膜纤维化或僵硬，以及骨赘或骨刺的形成。滑膜关节的大部分功能活动和结构框架由被称为软骨细胞的细胞控制。在正常情况下，这些细胞调节细胞外基质(ECM)的周转，维持组织的动态平衡。然而，机械力、老化和潜在的慢性炎症驱动软骨细胞的差异性变化和凋亡，导致关节退行性疾病。

目前的治疗方案，如皮质类固醇和非甾体抗炎药，试图缓解疼痛和炎症，但如果长期使用，可能会被证明是有害的。为了评估Ampion治疗作为疾病改进的一种途径，一系列体外培养将进行旨在关注药物对软骨细胞生物学影响的调查。

目标

1.开发并确认将模拟关节软骨软骨细胞生物学的模型。

2.调查使用安培恩在保存软骨和软骨再生或软骨重建术中的治疗。

材料与方法

1.软骨细胞/软骨生成模型

a.基本原理。

为了实现我们的项目目标，必须有一个模型来评估软骨细胞细胞标志物的表达和功能。离体人类软骨细胞模型，既来自正常组织，也来自骨关节炎组织，将被用来模拟软骨生物学，并在以后

受到炎症和/或机械激活的挑战，表现出疾病的迹象。软骨细胞培养的挑战之一是众所周知的，这些细胞在从体内移出后会迅速“去分化”。因此，它们需要被仔细地概括到它们的原始状态。因此，将对几个协议选项进行评估，以确认它们显示出必要的功能动态。这些将包括但不限于将细胞扩展到工作细胞库，然后：

在软骨生长因子存在的情况下进行培养，

三维(3D)培养技术，以及

对上述文化的时间分析。

这些模型将在细胞中进行测试，安培恩(AR-100和AR-300)，并考虑具体指标。

b.材料和试剂。

市场上可获得的软骨细胞来源于正常和/或骨性关节炎膝关节组织和伴生生长介质。

二、

软骨细胞分化介质。

三、

三维细胞培养基质。

四、

消耗性细胞培养器皿，包括培养皿、吸管等。

用于细胞分化的重组细胞因子。

c.方法论。

I.细胞的堆积。

1.所有购买的细胞将按照标准或推荐的方案进行扩展，然后为实验准备好细胞库。这些储存库将由储存在液氮中的个人使用的小瓶组成。

二、软骨细胞的单层培养。

最简单的评估模型将是在标准组织培养塑料上单层培养软骨细胞。

银行细胞将使用基础培养液配方作为对照进行培养，并与含有软骨形成信号的培养液(即TGFP)进行比较。

职业选手。

答：这种模式将允许最高的药物测试吞吐量。

反对意见。

有证据表明，这种模型可能会导致最高水平的可变性，这将被捕获并记录在研究报告中。

使用这种方法，细胞也会受到去分化伪影和较差的软骨形成特性的影响。

三、微团培养。

为了改善软骨细胞的功能，高密度软骨细胞“颗粒”将在组织培养板和/或低结合管中培养。

这些培养将进行7至21天的评估。

职业选手。

按照这种方法，细胞将很容易在培养中作为自由漂浮的颗粒进行处理、加工和操纵。

反对意见。

一些关键标志物或软骨细胞功能可能需要长达21天的时间才能明显检测出来。

四、3D文化。

将软骨细胞放置在海藻酸盐和胶原胶中进行三维培养。

与微团培养一样，这些培养将进行7至21天。

职业选手。

有证据表明，3D培养是建立软骨细胞特性的最佳模型。

反对意见。

一些关键的功能标记可能需要长达21天的时间才能完全表达。

凝胶必须在细胞分析之前被降解。

凝胶成分可能不适合进行质谱分析。

2.软骨细胞模型及药物干预

基本原理。

上面列出的软骨细胞培养阶段将被用来确定被认为适合于内部“生物测定”使用的技术。值得注意的是，这些生物检测不会严格按照USP标准进行验证。相反，我们将利用这一阶段来确定证明1)可重复的指标和2)为有意义的药物测试和统计分析提供足够的动态范围的指标。为了加快药物发现过程，这些实验将使用适当的控制措施以及安培恩(AR-100和/或AR-300视情况而定)。

b.材料和试剂。

消耗性细胞培养器皿，包括玻璃板、盖片等。

二、

免疫染色抗体和试剂。

三、

用于激活细胞的重组细胞因子。

四、

定量聚合酶链式反应平板和试剂

c.方法论

模型中软骨细胞功能和标志物的确认或确认。

1.软骨细胞表型将使用如下标记来确定。

A.提出软骨细胞表型分析。

分解代谢：基质金属蛋白酶的表达和ROS产生酶。

二、

合成代谢：Col2al、TGFb、BMP、IGF-1。

三、

肥厚性：Col IO和Runx2

四、

去分化：大学

B.其他重要的标志。

蛋白水解酶包括但不限于基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-3和基质金属蛋白酶-13。

二、

Sox9.

三、

阿格利坎。

C.使用以上的引物对和/或市场上可获得的阵列，通过RT-PCR进行分析和定量。

D.通过免疫染色、Western印迹和/或细胞内Western印迹分析和量化以上选择的抗体。

细胞分泌学和蛋白质组学分析将通过创伤研究质谱仪核心中心进行。

培养中ECM的完整性和/或组成也将通过创伤研究、质谱分析和阿尔辛蓝染色进行蛋白质组学分析。

将标记物表达与去分化细胞和/或生理盐水对照进行比较。还应确定适当的阳性对照和阴性对照，并用于比较分析(非甾体类抗炎药、地塞米松等)。

二、

探索免疫或机械刺激模型。

在标记物开发和确认之后，模型将使用促炎细胞因子和/或使用TR压力室的机械应力来挑战。

然后对已证实的标记的表达进行评估安培恩并设对照组。

3.间充质干细胞模型

基本原理。

软骨形成和/或软骨细胞生物学的模型也可以从原代干细胞培养中衍生出来。遵循这些方法，体外培养软骨细胞可以从间充质干细胞产生，这里将提到作为上述替代方法的软骨细胞。这些细胞将在上面描述的软骨细胞模型之后进行探索。

材料和试剂。

1.骨髓间充质干细胞。

11.传代和分化培养基。

111.上面列出的培养器皿和染色/检测材料。

方法论。

1.总之，骨髓间充质干细胞的微团培养将进行21天，以产生软骨细胞样细胞。

11.将如上所述确定衡量标准和标记。

4.滑膜细胞模型

a.基本原理。

滑膜细胞是滑膜关节中最丰富的细胞类型之一。这些细胞包括滑膜衬里和产生滑液的功能，滑液为关节提供润滑，也为软骨细胞提供营养。滑膜细胞有两种不同的类型：A型巨噬细胞样和B型成纤维细胞样。由于这些细胞直接与软骨细胞相互作用，并可能参与骨性关节炎的病理过程，我们还建议在建立上述模型后，也应进行这些细胞的共培养。

b.材料和试剂。

初级滑膜细胞。存在商业上可用的来源，应该包括A型和B型细胞。

二、

伴生扩展媒介。

三、

组织培养板嵌入物。

四、

激活细胞的细胞因子。

c.方法论。

1.滑膜细胞与软骨细胞的共培养。

为了评估软骨细胞和滑膜细胞之间的潜在相互作用，可以在Ampion存在的情况下进行这些细胞类型的共培养，并对上述指标进行量化。

为了实现这一点，含有软骨细胞凝胶或颗粒的细胞培养片将被添加到具有已建立的滑膜细胞单层的板孔中。

激活细胞因子(.即IL-1和/或TNFa)然后可以添加到插入物的任一侧。

然后可以在选定的时间点对条件培养液、RNA和总蛋白提取物进行评估。

二、

滑膜细胞条件培养液培养软骨细胞。

作为一种替代方法，来自滑膜细胞的条件培养液可以放置在软骨细胞培养上。

预算和时间表

软骨细胞

将对上面列出的方法进行协调评估，以确定最适合内部使用的模型。除早期开发的生理盐水和药物治疗组外，还将确定和测试所有适当的阳性和阴性对照，以加快初步数据的产生。由于这些培养技术需要较长的时间，这一阶段将需要大约3-4个月的时间来确定方法。还需要3-4个月的时间来收集复制品进行统计分析。

骨髓间充质干细胞与滑膜细胞

干细胞方法学是上述软骨细胞培养技术的替代方法。如果最初的软骨细胞培养实验似乎不符合研究要求，上面列出的预算可以转到BMMSC试剂上，而不需要进行任何可预见的调整。

滑膜细胞的建议高度依赖于软骨细胞模型表征的成功，并将在必要时进行。

Ampion对炎症体抑制作用的研究

背景

炎性小体是一种多蛋白的炎性复合体，可以激活caspase产生细胞因子并诱导下垂。此外，这些关键的炎症特征与感染、炎症和自身免疫条件下IL-1β和IL-18的释放密切相关。因此，靶向该通路具有深远的治疗意义。

我们先前已经证明，Ampion能够抑制内毒素或TLR7/8激动剂分别从外周血单核细胞和THP-1激活的细胞释放IL-1β。为了探索Ampion在OA之外的扩展，将对炎性小体信号进行更深入的研究。

目标

建立特定的炎症体和途径(即典型的和非典型的)，负责通过以下方式抑制IL-1β的释放安培恩在免疫细胞中支持靶向适应症的扩大安必恩。

材料与方法

要采用的细胞培养模型。

单核细胞系包括未成熟和分化的THP-1和U937细胞。

原代单核细胞

单核细胞来源的巨噬细胞和/或树突状细胞。

中性粒细胞

上皮细胞

差异化协议

PMA

M-CSF或GM-CSF用于MO分化，然后1)IFNY=m1，2)IL-4和/或IL-13=M2或树突状细胞

转录组

QPCR阵列和/或选择靶标

蛋白质组学与代谢组学

Westernblot

靶点：Caspase 5、Caspase 1、NLRP(NLRP3和NLRP12)物种、AIM2等。

使用标准协议和/或小区内执行。

下拉确定受Ampion影响的络合物

免疫染色

评估炎性小体复合体蛋白在细胞中的定位。例如，微管蛋白和NLRP3一起确定乙酰化增加是否与缺乏核周定位相关。

SiRNA基因敲除

击倒目标炎症体蛋白以确定对Ampion活性的影响。

酶联免疫吸附试验检测IL-Iβ

测定使用和不使用安必恩的每种模型的分泌IL-Iβ水平

预算和时间表

对Ampion介导的抑制炎症小体的研究将包括优化炎症细胞类型的培养和治疗条件，包括导致膝关节慢性炎症的几种不同类型的细胞，如软骨细胞、滑膜细胞和免疫细胞。与软骨生成项目相比，这项工作可能会遵循类似的预算和时间表。

3.蛋白质组学和代谢组学分析

背景

组织或细胞中所有蛋白质的总和称为蛋白质组。蛋白质组学研究蛋白质及其在生化过程中的数量、结构、修饰和功能作用。蛋白质是细胞行为和细胞动态平衡的最终效应者，蛋白质组学让我们得以一窥这些过程是如何被调控的。此外，由于许多疾病倾向于在蛋白质水平上表现，了解蛋白质组在健康与疾病或对药物治疗的反应中如何不同或变化是至关重要的。

代谢组学可以被认为是代谢功能的最新状态，因为代谢物的变化可以发生在几秒钟到几分钟的时间尺度上。通过对代谢物和其他小分子进行量化，可以了解哪些代谢途径是活跃的。例如，细胞正在消耗的糖和氨基酸以及产生的副产品暗示了细胞正在使用哪些能量途径来制造能量。在药物治疗后，代谢组学可以用来揭示药物是如何改变细胞代谢的，以及药物是如何代谢的。

目标

1.支持两个目标：1)软骨形成，以支持疾病改良性骨关节炎药物(DMOAD)的应用；以及2)炎症组的作用机制，通过识别因下列原因而改变的蛋白质和代谢物，支持目标适应症和在骨性关节炎之外的开发应用安培恩用液质联用(LC-MS)进行定量处理。

材料与方法

设备和消耗品

Acquity UPLC BEH C18色谱柱

Acquity UPLC BEH酰胺柱

打珠机

10kd截留分子量过滤器(MicroCon或ViVacon)

排在前14位的耗尽柱(如果会接触白蛋白或血液)

皮尔斯快速金标BCA蛋白检测试剂盒

皮尔斯C18旋转技巧

Waters自动取样器

1.5ml和2.0ml低蛋白结合管

玻璃珠0.5 mm-1.0 mm

试剂

用于LC-MS的所有试剂都需要是超纯级的，包括ReagentPlus和液体溶剂的Optima级。

重标记代谢物标准。

顺序级胰酶

软件

麻省山猫

吉祥物服务器

吉祥物蒸馏器和守护程序

脚手架构件

蛋白质组学

样品准备

所有样品都将按照优化的FASP(过滤器辅助样品制备)方案进行处理。这涉及到在分子量截断过滤器上捕获蛋白质。然后，捕获的蛋白质经过变性和广泛的洗涤，然后被胰酶消化一夜。

11.消化后收集的多肽将用C18树脂旋转头脱盐、洗涤和清理。清洗后的多肽随后将被洗脱到水自动取样器中，用于LC-MS上的注射。

LC-MS分析与数据分析

多肽将被注入Waters Acquity UPLC BEH色谱柱，并以3小时的梯度运行。

11.然后将使用吉祥物服务器和程序吉祥物守护程序搜索每个样本的原始数据文件以寻找身份。

Daemon的Excel报告将用于推进蛋白质报告和数据分析，使用以下但不限于：

Metover Analyst

独创性路径分析

代谢组学

样品准备

所有样品都将按照优化的代谢物提取方案进行处理。将使用极性裂解缓冲液(50/30/20MeOH/ACN/H2O)从细胞和组织中提取亲水性代谢物

LC-MS分析与数据分析

I.代谢物将被注入Waters Acquity UPLC BEH色谱柱，并以10分钟的方法运行

11.将使用脚手架元素程序搜索每个样本的原始数据文件

111.数据分析和报告可以在Scaffold Elements中完成和生成。

预算和时间表

由于这项技术的敏感性，LC-MS的试剂质量必须严格，这将作为传递成本计入Ampio。此外，与蛋白质组学和代谢组学相关的成本集中在回答研究问题所需的试剂类型上。例如，用重原子标记的蛋白质或代谢物在量化特定蛋白质/代谢物时被用作标准。然而，对于半量化来说，没有必要有一个沉重的标准，所以这取决于初步的结果导致Ampio。运行LC-MS、处理数据和解释结果将需要训练有素的研究人员花费大量时间。

由于tr Omics集团将处理从研究组其他部门移交的样本，时间将受到收到样本的影响。一旦样品拿到手，蛋白质组学的样品准备通常需要2天。代谢组学样品制备可以在一天内完成并进行分析。蛋白质组学LC-MS运行时间为每个样品3小时。代谢组学的运行时间为每个样本10-30分钟。一旦获得这些数据，处理、分析、报告编写和图形生成将在完成实验的4-6周内交付。

Omics团队将提供蛋白质和代谢物鉴定报告、相应的原始数据和团队指导的图形，以帮助可视化报告结果，这些结果将在研究报告中总结。这些数据将在几个方面帮助指导研究小组：1)阐明软骨细胞生物学中差异调节的蛋白质和代谢物

4.生物信息学

背景

安培恩已被临床证明可以减轻Oak患者的疼痛并推迟全膝关节置换术。对骨性关节炎软骨细胞和间充质干细胞的体外研究支持Ampion促进软骨形成和软骨修复的假设；然而，这些研究集中在少数选定的基因和蛋白质上。因此，有必要对Ampion促进软骨形成的能力有更广泛的了解。全面和公正的生物信息学分析使我们能够发现复杂的生物系统，例如由Ampion推动的软骨形成的促进。橡树患者的软骨生成增加将被认为是这种疾病的一种改进，通过用生物信息学描述Ampion的效果，全面的理解可能支持这样的观点，即Ampion既是一种对症治疗，也是一种改变OA患者生物特征的疾病。

作为一种生物，Ampion含有几种已知和未知的成分。测试Ampion治疗意义的有效方法是描述Ampion调节的基因表达(转录)、蛋白质(蛋白质组学)和代谢途径(代谢组学)的细胞变化。这些“组学”数据集非常大，很难解释，因为在数万到数千个分子之间建立联系，以及它们如何与细胞过程相关，从人类的角度来说是不可能的。

为了帮助这些类型的分析，生物学和计算科学领域联合起来形成了生物信息学。独创性路径分析(IPA)是一种生物信息学软件，它包含了生物分子、化学物质和药物之间生物相关联系的巨大“知识库”。与其他在线生物信息学软件不同，IPA知识库是由科学家从已发表的文献中手工策划的，因此不仅包含与生物相关的联系，而且包含它们监管的后果。例如，分子A调节

100个可能改变细胞行为的不同基因。通过治疗，分子A被激活，40个基因增加，这反映在数据集中。IPA分析数据集，并预测这些特定基因表达增加的细胞后果(增加/减少增殖、抗炎/促炎等)。

与对照处理相比，以Ampion为特征的有限的历史组学数据表明，在所分析的不同细胞类型之间，Ampion调节独特的靶分子。通过生成组学数据集来扩展我们对Ampion靶分子的了解，我们将研究未来进一步发展其他疾病适应症的机会。

值得注意的是，以人类疾病状态或人类疾病动物模型为特色的组学数据集的公共领域已经大大扩大。数以千计的数据集可供下载、处理和分析。这些数据集中的许多都是从同行评议的手稿中发布的。

Ampio研究计划的生物信息学部门的主要目的是通过与公共疾病组学数据集进行比较，在细胞或组织中受Ampion调控的分子之间建立生物相关的联系，以及这与Ampion的治疗潜力之间的关系。

目标

1.IPA上传Ampio PharmPharmticals生成的历史数据的流程。

2.分析和解释Ampio PharmPharmticals产生的历史数据。

为未来Ampio制药组学数据集的实验设计提供指导。

使用Qiagen CLC基因组工作台或R编程软件处理Ampio Pharmtics历史或未来的原始数据，以生成上传到IPA的数据集。

分析IPA中的Ampion数据集并报告结果。

6.比较不同细胞类型和条件下的Ampion数据集。

7.解释由Ampio PharmPharmticals生成的未来组学数据集的IPA结果。

8.使用Qiagen CLC基因组学工作台或R编程软件获取和分析人类疾病的数据集，或如有必要，获取和分析人类疾病的动物模型，并准备将它们上传到IPA并与Ampion数据集进行比较。

9.将Ampion基因组数据集与人类疾病的公共数据集进行比较，如果必要的话，也可以与人类疾病的动物模型进行比较。

10.

制作研究报告并存放到Ampio PharmPharmticals的M驱动器，其中包括所有数据、编程脚本、IPA摘要和感兴趣的图表，以传播研究结果。

11.

根据具有重要科学意义的发现撰写和修改手稿。

12.

在同行评议期刊上发表进一步开发Ampion药物的手稿。

资源与材料

●

受过组学数据集生成、分析和解释培训的博士生

●

计算资源，包括高速互联网、服务器支持、计算机、显示器和其他计算机外围设备

●

QIGEN软件许可(IPA和CLC基因组学工作台)

●

R编程和相关软件

●

来自实验的历史数据，将Ampion与对照治疗进行了全面的实验设计和细节比较。未以IPA上载格式接收的数据将需要处理

●

来自未来实验的原始组学数据，将Ampion与对照治疗进行全面的实验设计和细节比较

对M驱动器的网络访问

●

与出版手稿、彩色插图和手稿开放获取有关的费用

方法论

原始组学数据分析

《中图法》基因组学工作台将用于通过包括序列修剪、质量控制、基因组比对和读数量化的工作流程来处理原始RNA测序(FASTQ)文件。组学(转录组、蛋白质组学和代谢组学)计数数据的统计分析将在R编程软件中执行[1]使用DESeq2[2]包裹。为了确定Ampion log2折叠变化对靶分子调控的差异，将计算p值和调整后的p值。具有调整的p值的基因

在二氧化硅途径分析中

计算出的差异基因表达值将被上传到Inenvenity Path Analysis(IPA)软件(美国加利福尼亚州雷德伍德市的Qiagen Digital Insights)。Expression核心分析将基于Expression Log Ratio运行，调整后的p值为0表示激活或类似的调节，z

预算和时间表

Ampion对免疫刺激的PBMCs转录影响的生物信息学分析目前正在进行中。这篇题为《LMWF5A(Ampion)演示了一种抗炎作用模式和与活化PBMC中地塞米松类似的药物靶点》的手稿正在接受《分子生物学报告》的同行评审。这些数据还将被用来在安培恩和软骨生成。直接分析来自炎症体和软骨细胞实验的组学数据将取决于原始数据接收的时间。

根据每个实验处理原始数据的水平，非全职科学家最终上传到IPA可能需要3-4周的时间。综合行动计划的全面分析是一个持续的过程，取决于所显示的数据和出现的感兴趣的领域。对于兼职科学家来说，分析和完成手稿可能需要3-6个月的时间。研究报告将在完成工作的4-6周内提交，总结所有工作的完整报告将每季度提交一次。

数据集分析将存储到Ampio PharmPharmticals的M驱动器服务器。该格式将是一份研究报告，包括重复分析所需的所有文件。

这些文件可能包括但不限于原始数据、编程脚本、IPA摘要和感兴趣的图表。

被确定为有助于药物开发的结果和发现安培恩将被写成手稿，并在赞助商批准的情况下提交给同行评审的期刊。收到审阅的稿件后，如有必要，技术代表将处理审稿人的意见并对稿件进行修改。

5.预算摘要

调查	时间表	成本
1.软骨细胞/软骨生成		$100,000
2.炎性小体		$50,00
3.蛋白质组学和代谢组学		$50,00
4.生物信息学		$50,00
总计	12个月	$250,000
直通估算		$150,000

付款条款：创伤研究有限责任公司(TRLLC)将向Ampio开出每月20,833.33美元的发票，这相当于每月的调查费，为期十二(12)个月，代表调查期。发票的付款应在收到发票后十五(15)天内到期并支付。此外，TRLLC应向Ampio开具发票，以支付与研究计划计划中进一步定义的调查工作相关的传递费用。传递成本的发票应对此类成本有合理的支持，并不排除任何加价I 间接费用，应在收到发票时到期并支付。

可交付成果：研究报告将在完成工作的4-6周内滚动提交，总结迄今完成的所有工作的完整报告将每季度提交一次。预计这项工作将产生两份同行评议的出版物。

预计开始日期：2022年1月31日

预期终止日期：2023年1月31日

赞助商提供：测试文章和2个FTE资源

TR提供：如上所述

传递成本：试剂、消耗品的估计预算，以及潜在的超支

提供来源检测(即酶联免疫吸附试验阵列分析)。TR将负责订购和结算直通成本。

预算审批

批准按说明继续进行：


公司：		承包商：

Ampio制药公司		创伤研究有限责任公司


由以下人员提供：	迈克尔·A·马蒂诺	由以下人员提供：
姓名：	迈克尔·A·马蒂诺	姓名：	大卫·巴尔-或者
标题：	董事长兼首席执行官	标题：	董事