肿瘤学年鉴 2016年3月27：1241-1248 DOI：10.1093/annonc/mdw150在线发布2016年3月30日

评价HER2肽AE37疫苗预防乳腺癌复发的前瞻性、随机、单盲II期试验的初步分析

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1美国休斯敦德克萨斯大学MD安德森癌症中心乳房外科肿瘤学系；²癌症免疫学和免疫治疗中心，圣萨瓦斯癌症医院，雅典，希腊；³夏洛特市莱文癌症研究所肿瘤生物统计系；⁴休斯顿德克萨斯大学MD安德森癌症中心乳腺内科； ⁵休斯顿山姆堡布鲁克陆军医疗中心血液科/肿瘤科；⁶癌症疫苗研发 贝塞斯达健康科学大学整装服务大学外科实验室；⁷休斯顿山姆堡布鲁克陆军医疗中心外科；⁸抗原快递，伍斯特；⁹圣安东尼奥癌症疫苗开发项目¹⁰美国贝塞斯达健康科学大学统一服务学院外科系

2015年12月20日收到；2016年3月17日修订；2016年3月19日接受

背景：AE37是MHCⅡ类多肽AE36(HER2 AA：776-790)的Ⅱ键杂交体。I期研究表明，AE37联合粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)治疗是安全和高免疫原性的。一项前瞻性、随机、多中心的II期佐剂试验被用来评估疫苗的有效性。

方法： 临床无病、淋巴结阳性和高危淋巴结阴性的乳腺癌患者，肿瘤表达任何程度的HER2。[免疫组织化学(IHC)1-3+]都被录取了。患者被随机分为AE37+GM-CSF组和单独使用GM-CSF组。毒性监测 。记录临床复发情况，并分析无病生存期(DFS)。

*通信 收件人：伊丽莎白·A·米滕多夫博士，德克萨斯大学MD·安德森癌症中心乳房外科肿瘤科，美国德克萨斯州休斯顿，77030，普雷斯勒街1400号。电话：+1-713-792-2362；电子邮件：eamitten@mdanderson.org

© 作者2016年。由牛津大学出版社代表欧洲医学肿瘤学协会出版。保留所有权利。 有关权限，请发送电子邮件至：Jourals.Permission@oup.com。

结果： 本试验共纳入298例患者，153例接受AE37+GM-CSF治疗，145例仅接受GM-CSF治疗。两组患者的临床病理特征匹配良好。毒性一直很小。在初步分析时，接种疫苗组的复发率为12.4%，而对照组为13.8%[相对风险降低12%，HR 0.885，95%可信区间(CI)0.472-1.659， P = 0.70]。Kaplan-Meier估计，接种疫苗的5年无病生存率为80.8%，而对照组为79.5%。在对IHC1+/2+HER2表达肿瘤患者的计划亚集分析中，接种疫苗的患者5年无瘤生存率为77.2%(n =76)，而对照组为65.7%(n = 78) (P=0.21)。在三阴性乳腺癌(HER2、IHC1+/2+和激素受体阴性)患者中，接种疫苗的患者DFS为77.7%(Pn=25)，而对照组为49.0% (n = 25) (P = 0.12).

结论： 总体意向治疗分析显示接种疫苗无益。然而，研究结果证实，

疫苗是安全的，并表明接种疫苗可能对HER2低表达肿瘤(尤其是TNBC)患者有临床益处。在一项招募TNBC患者的随机试验中进一步评估是有必要的。

关键词：免疫疗法、疫苗、乳腺癌、三阴性乳腺癌、HER2

引言

人们对使用免疫治疗策略(包括疫苗)治疗癌症患者非常感兴趣。在乳腺癌中，HER2是被研究最多的抗原，几种HER2衍生的多肽疫苗已被证明能激发免疫反应。 研究最多的是E75，它是一种主要组织相容性I型疫苗，可以刺激CD8。⁺T细胞反应[1]. 而CD8⁺T细胞诱导的疫苗可激发针对靶抗原表达的肿瘤的细胞溶解活性，因此疫苗特异性免疫应答的持久性令人担忧 。在评估E75的早期试验中，随着时间的推移，人们注意到多肽特异性免疫力的减弱；考虑到CD8，这并不出人意料。⁺在没有持续抗原暴露和抗原提呈细胞刺激的情况下，T细胞不能维持长时间的记忆反应。[2]。增强免疫应答和维持长期免疫的一种策略是联合使用刺激CD4的MHCⅡ类表位。⁺ 辅助性T细胞应答[3, 4].

已经描述了HER2蛋白的几个MHCⅡ类表位，包括AE36[5–8]。与I类表位相比，II类表位具有更低的结合 亲和力。为了解决这个问题，一种增加CD4抗原特异性刺激的新方法⁺辅助性T细胞已经被研究过了。AE37是由II-key 肽(LRMK)与AE36氨基末端共价连接而成的杂交肽(Sears等人综述)。[9])。此II-键部分增强了表位电荷，从而改善了抗原呈递[10–12]。临床前工作评估了一系列II-键杂交肽，结果表明它们在刺激肽特异性CD4方面比天然肽更有效。⁺T细胞。此外，杂交肽诱导

+

方法

患者 特征和临床方案

研究是一项前瞻性、随机化、单盲、多中心试验(NCT00524277)，是在研究新药 应用(BB-IND#12229)下进行的。该议定书在所有16个参与地点都得到了机构审查委员会的批准。符合条件的 有一定程度HER2表达的淋巴结阳性或高危淋巴结阴性乳腺癌患者[IHC 1-3+和/或荧光 就地杂交(FISH)比>1.2]。高危淋巴结阴性定义为：≥T2，3级，激素受体阴性，IHC或FISH扩增的HER2 3+>2.0(在CAP/ASCO指标改变前)，有淋巴血管侵犯，或有分离的肿瘤细胞(N0(I

+)) 。登记发生在完成标准治疗后1-6个月，包括手术、化疗和放疗(如果有适应症)；接受内分泌治疗的患者继续接受他们的处方方案。该试验的目的是确定接受AE37+GM-CSF治疗的患者与仅接受GM-CSF治疗的患者的复发率是否存在差异。该方案要求对39起事件进行初步分析，这些事件被定义为复发、第二种恶性肿瘤、 或任何原因导致的死亡。

疫苗 和疫苗接种系列

AE37肽(LRMK-GVGSPYVSRLLGICL)以良好的生产实践等级生产，纯度>95%。无菌，内毒素，

CD4 T细胞对HER2特异性的辅助作用更强

CD8⁺ T细胞[13].

我们的 小组在乳腺癌患者中首次进行了AE37+GM-CSF的人体I期试验。试验表明，该疫苗是安全的，能够诱导多肽特异性免疫反应。[14]。随后，我们进行了一项前瞻性、随机、 多中心II期试验，研究在辅助环境下使用AE37+GM-CSF治疗淋巴结阳性和高危淋巴结阴性的乳腺癌患者，这些患者的肿瘤表达任何程度的HER2。[免疫组织化学(IHC)1-3+]。这项研究的主要目的是确定接种疫苗是否可以降低复发率。在这里，我们报告初步的分析。

图 1.CONSORT图病人在研究中流动。星号表示，对照组中有三名患有第二种恶性肿瘤的患者中有一人退出了试验 ，并包括在七次试验中。Cirumfex符号表示 未完成主要治疗系列(PVS)的患者数包括退出、达到主要终点(复发、 第二次恶性肿瘤或死于任何原因)或选择在完成PVS之前不再继续研究的患者。

A统计分析中不包括未知的 值。

和 制造商进行了一般安全测试。冻干肽在0.5ml无菌生理盐水中重组，剂量为500µg，与GM-CSF混合，最后加入无菌生理盐水1ml。最初，根据I期试验的数据使用了62.5微克的GM-CSF[14]。然而，由于最初的26例患者(AE37+GM-CSF组12例，GM-CSF组14例)局部反应不明显，GM-CSF剂量被增加到125µg。对于仅接受免疫非佐剂治疗的患者，GM-CSF用无菌生理盐水稀释至最终1ml体积。

初级疫苗接种系列(PVS)包括每21-28天接种6次。1.0ml的疫苗接种(疫苗或单独接种GM-CSF)与0.5ml皮内注射在同一区域相距5 cm的两个部位分开。

淋巴 淋巴结引流区域(大腿上部)。从登记之日起12个月、18个月、24个月和30个月，在与初级系列相同的四肢进行四次强化接种。

在 活体中免疫监测

在 活体中免疫反应采用迟发型超敏反应(DTH)。皮下注射AE37(Br)100微克/0.5ml生理盐水，AE36 100µg/0.5ml生理盐水(容量控制)。 皮内预防接种，PVS完成后1个月。用灵敏圆珠笔法测定注射后48-72h的二维潜伏期。[15]。数据按正交均值记录。

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图 2.最大毒性。使用AE37+GM-CSF疫苗的患者所经历的最大局部和全身毒性与单独使用GM-CSF的患者相似。

前 活体免疫监测

前 活体免疫反应通过放射性评估。³H-胸腺嘧啶核苷掺入试验评估所有患者的肽特异性T细胞增殖。简单地说，外周血单个核细胞(PBMC)在没有和存在AE36和AE37肽的情况下培养。第4天，井内注入1µCi/孔的放射性脉冲³H-胸腺嘧啶核苷。 第二天，通过测量胸腺嘧啶核苷掺入量(以每分钟计数 )来测定细胞增殖活性。结果用δcpm表示，即肽存在时的cpm减去介质中的cpm。

此外， 在部分患者(n =97)，干扰素-γ(IFN-γ)用如前所述的标准酶联免疫斑点(ELISPOT) 进行评估[16]。进行检测，比较接种疫苗的患者(n =53)与对照组患者 (n =44)在基线和多个疫苗后时间点。在这个亚群中也评估了调节性T细胞(Treg)的水平，并进行了组间比较。流式细胞仪分析Treg，定义为CD4+CD25hiCD127 low/neg， 表达为所有CD4+T细胞的百分比。

临床 疾病复发

根据肿瘤学家的标准筛查，对患者 进行疾病复发评估。如果患者的复发是经活检证实的，或者如果他们接受了复发治疗，那么他们就被认为是复发性疾病。

统计 分析

这项 研究旨在检测与2年无病生存率(DFS)改善相对应的0.45风险比(HR)，从只接种GM-CSF的对照组患者的85%提高到接种AE37+GM-CSF的患者的93%。入选患者按地点和结节状态分层，之后使用计算机化表格将他们随机分配到两个治疗组，分配比为1：1 ，使用机构平衡算法。根据统计分析计划，这项意向治疗(ITT)(所有 名随机患者)初步分析是在39个事件之后进行的。

对基线患者和疾病特征进行了DFS的预先指定的 亚组分析。组间比较临床病理资料。用中位数和极差汇总年龄，组间比较采用方差分析，基线分类变量汇总频数和比例，组间比较采用双侧Fisher‘s精确检验。DTH数据以均值±标准误差表示，并使用配对学生的 进行比较t-测试。免疫学检测结果用Wilcoxon(双尾)进行比较。t-测试。计算从随机化之日起至因任何原因复发或死亡之日的DFS，否则在最后一次接触之日删减DFS，采用Kaplan-Meier技术分析DFS，组间比较采用log-ranch检验。Cox比例风险模型用于估计HRs，95%可信区间(CI)用于估计两组之间复发或死亡的相对风险 。P 值

结果

病人

试验招募了298名患者(图1)。在临床病理特征方面，各组之间没有差异(表1)。

毒性

PVS期间局部和全身毒性轻微(图2)。接受AE37+GM-CSF治疗的患者，最大局部毒性为1级(72%)或2级(28%)。极大值

全身毒性为0级(36%)、1级(53%)、2级(11%)或3级(1%)。毒性与仅接受GM-CSF治疗的患者相似。

免疫应答

在 活体中通过对AE36和AE37的DTH反应评估免疫学反应。对于接种疫苗的患者，接种后的DTH反应与接种前的DTH反应相比，有统计学意义的增加(图3A)。离体分别在PVS中途、PVS完成后1、6、12个月检测AE36和AE37特异性T细胞增殖反应。如图3B(AE36) 和C(AE37)所示，在接受疫苗接种的患者中，T细胞对AE36和AE37的增殖比只接受GM-CSF的患者更强。

在 患者子集(n =97)、ELISPOT(图4A)和Treg水平(图4B)也在接种疫苗(n =53)和控制(n =44)例。如图4A所示，AE36和AE37的多肽特异性干扰素-γ的释放在基线和疫苗后1个月之间有统计学上的增加，而对照组在疫苗后没有看到增加。尽管存在CD4诱导疫苗的理论问题，图4B显示疫苗组的Treg水平没有增加 ，实际上在疫苗接种后6个月，与基线和对照 组相比，该时间点的Treg水平在统计上有所下降。

无病存活

接种组复发率为12.4%，对照组为13.8%(HR 0.885，95%CI 0.472-1.659，P =0.70)。Kaplan-Meier估计DFS利率为5年

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图 3.接种疫苗后的免疫反应。(A)活体内采用迟发型超敏反应(DTH)测定所有患者的免疫反应。接种AE37+GM-CSF的患者与接种前相比，接种后对免疫肽AE37和野生型多肽AE36的DTH反应均显著增加。 接种前AE36的平均(±标准差)正交平均值为2.0±0.4 ，而接种后为16.0±1.2 mm(PP

中位随访25个月后，接种疫苗组为80.8%，对照组为79.5%(图5A)。在HER2阳性(即IHC3+或FISH>2.0)肿瘤患者的计划子集分析 中，接种疫苗的患者估计5年无病生存率为83.2%(n =77)，而对照组为88.0%(n =67)(HR 1.493，95%CI 0.529-4.218，P = 0.45)

(图 5B)。对于IHC 1+或2+HER2表达的肿瘤，

在接种疫苗的患者中，估计5年DFS为77.2%(n =76)，而对照组为65.7%(n =78)(HR.595，95%CI 0.263-1.347，P =0.21)(图5C)。在三阴性乳腺癌(TNBC，HER2 IHC 1+或2+，激素受体阴性)患者中，接种疫苗的患者估计5年DFS率为77.7%(Pn =25)，而对照组为49.0% (n =25)(HR 0.403，95%CI 0.123-1.316，P =0.12)(图5D)。

讨论

在此， 我们报告了ITT对评估AE37+GM-CSF治疗无病的随机II期试验的初步分析。

在辅助性环境中，淋巴结阳性的 和高危的淋巴结阴性的乳腺癌患者。对整个随机研究人群的ITT分析 没有显示接种疫苗的患者复发率降低；因此，这是一项阴性试验。然而，这项研究具有很高的信息量。首先，该研究证实该疫苗在刺激抗原特异性免疫反应方面是安全有效的。其次，它确定了GM-CSF的最佳使用剂量，并表明，尽管GM-CSF对所看到的毒性是有反应的，但它并不对免疫逻辑反应负责。最后，这项研究表明，AE37+GM-CSF 可以降低特定患者，特别是TNBC患者的复发率，这为该疫苗的进一步临床开发提供了合适的患者群体 。

与第一阶段试验的数据一致 [14, 16]，这项研究证实疫苗是安全的，大多数患者只经历了1级局部和全身毒性。最常见的局部毒性是注射部位红斑和瘙痒；最常见的全身毒性是骨痛、流感样症状和疲劳。此症状与我们早期阶段的症状一致

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GM-CSF 单独使用AE37+GM-CSF

图 4.额外的免疫反应。(A)对部分患者进行干扰素-γELISPOT检测(n=97) 比较AE37+GM-CSF接种患者(n=53)，仅使用GM-CSF的对照组患者(n=44)在基线(疫苗接种) 和多个疫苗后时间点。结果以每10个特定点(减去背景)表示⁶ AE36(顶行)和AE37(底行)的PBMC。结果以中位数、极差和50%四分位数表示。*P

*P

NeliPepimut-S+GM-CSF的临床试验[2, 17]。在这项试验中，没有只有GM-CSF的对照臂；因此，不可能对多肽和/或GM-CSF产生毒性。在目前的研究中，仅使用GM-CSF组的毒性与接种疫苗组的毒性相似，这表明与这些疫苗相关的毒性可归因于免疫佐剂。

这项研究的另一个重要方面是我们确定了GM-CSF作为佐剂的最佳剂量。剂量和

GM-CSF作为一种免疫佐剂的潜在有害作用一直受到质疑(Clive等人评论。[18])。目前的试验以500微克AE37和62.5微克GM-CSF开始 ，剂量是根据I期试验的结果选择的[14]。在这项试验中，选择了500µg AE37加62.5µg GM-CSF的最佳剂量，因为一些接受500µg AE37加125µg GM-CSF的患者会出现较大的局部反应，需要减少GM-CSF剂量以防止严重的皮肤毒性 ，而30µg的GM-CSF剂量不足以产生强有力的

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疾病 自由存活时间(月)

图 5.(A)所有患者，(B)HER2过度表达的乳腺癌患者，(C)HER2 1+和2+肿瘤患者(无论荷尔蒙受体状态如何)，以及(D)三阴性乳腺癌患者 (HER2 1+和2+和激素受体阴性肿瘤)的无病存活率显示在意向治疗的基础上(A)所有患者，(B)HER2过度表达的乳腺癌患者 ，(C)HER2 1+和2+肿瘤患者，无论荷尔蒙受体状态如何，以及(D)三阴性乳腺癌患者 。

反应。 因此，选择62.5µg剂量开始当前试验；然而，在前26名患者通过PVS没有出现强烈的局部反应后，决定将GM-CSF剂量增加到125µg。这一发现 可能与制造商在I期和当前阶段之间改变GM-CSF配方有关

研究： 虽然该剂量耐受性良好，但疫苗组中20%的∼患者需要减少剂量，原因是

超过100毫米的局部 反应。重要的是，这些患者对该肽表现出较大的迟发型超敏反应，在临床上似乎表现较好 。[19].

尽管本试验中看到的毒性可以归因于GM-CSF，但免疫监测数据表明，免疫反应不能归因于GM-CSF。只接种GM-CSF的患者没有表现出HER2特异性的免疫反应，而接种AE37+GM-CSF的患者对AE36(原生肽)和AE37(免疫肽)都有很强的免疫反应。通过显示对AE36的免疫应答，这些数据证实了HER2特异性免疫。

AE37疫苗的一个关键方面是对LRMK序列的修饰，以促进MHC II类分子的装载。 临床前数据显示，与未经修饰的II类表位相比，这种效力增强了。[10–12]。我们没有只接种AE36肽的对照组。然而，健壮的体内和离体在本试验中看到的免疫应答 ，以及显示无佐剂活性的I期数据[14]，建议这一点

修饰 在不增加调节性T细胞水平的情况下确实增强了免疫应答。我们假设，II键/肽杂交物的直接充电能力允许这种杂交疫苗在携带人类白细胞抗原(HLA) 等位基因的患者中具有活性，而这些等位基因与天然AE36表位的相互作用很弱。[14]。这种增加的“乱交”有可能在临床上产生重大影响，因为它扩大了可能从接种疫苗中受益的患者数量。与仅限于具有特定I类等位基因的患者接种的MHC I类疫苗不同，AE37可以用于任何类型的HLA患者。

目前的数据表明，HER23+肿瘤患者并不能从AE37疫苗中受益。然而，应该注意的是，HER23+肿瘤患者的DFS率在试验的两个方面都是优秀的，这一发现反映了曲妥珠单抗治疗在这些患者中的益处。我们的DFS比率可与NSABP B-31和NCCTG N9831试验的综合分析 中看到的比率相比较[20]。应该注意的是，尽管本试验中的子集分析是预先指定的，但每个子集中的患者数量很少。然而，这些数据确实表明TNBC患者具有活动性，而TNBC患者是可能具有最强免疫原性的乳腺癌 亚型。多项新的试验正在评估免疫调节剂，如TNBC中的检查点抑制剂。 AE37疫苗可能会增强/增强对这一亚型的免疫逻辑反应，并可能单独或与这些药物联合使用显示出希望。对TNBC患者进行AE37的额外随机研究是有必要的。

供资

这项 工作主要由Antigen Express通过亨利·M·杰克逊基金会向GEP拨款资助。额外资金由美国军事癌症研究所(美国军事癌症研究所，健康科学大学整装服务大学外科)和沃尔特里德陆军医学中心临床调查部( )提供。EAM是德克萨斯大学MD安德森癌症中心R.Lee Clark研究员，由珍妮·F·谢尔比奖学金基金资助。这项研究部分是在德克萨斯大学MD安德森癌症中心进行的，该中心由美国国立卫生研究院拨款CA016672资助。资金来源 不参与研究的设计或实施；不参与数据的收集、管理、分析或解释 ；不参与报告的撰写；也不参与批准或决定提交论文发表。

EAM 和GEP有权完全访问研究中的所有数据，并负责数据的完整性和数据分析的准确性 。

披露

GEP 和SP对AE37具有部分Inventor权限。如果获得许可，根据联邦政策，他们有权获得与本许可证相关的财务收益 。GEP还为疫苗的开发提供咨询。EVH是Antigen Express的总裁。JS是Antigen Express的无偿 顾问。所有剩余的作者都已宣布没有利益冲突。

本文表达的观点仅代表作者的观点，并不反映布鲁克陆军医疗中心、美国陆军医疗部、美国陆军卫生局、陆军、国防部或美国政府的官方政策或立场。

参考文献