临床癌症研究

癌症 治疗：临床

该新药的I期临床研究结果

Ii-Key/Her-2/纽前列腺癌患者接种(776-790) 杂交肽疫苗

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埃里克·冯·霍夫(Eric Von Hofe4)和康斯坦丁·N·巴克斯瓦尼斯(Constantin N.Baxevanis)1

摘要

目的：主动免疫治疗正在成为前列腺癌的一种潜在的治疗方法。

我们 进行了II-Key/HER-2/的第一阶段试验纽以重组粒-巨噬细胞集落刺激因子为佐剂的(776-790)杂交肽疫苗(AE37)在HER-2/HER-2患者中的应用纽+前列腺癌。这项研究的主要目的是评估毒性和监测患者对疫苗的免疫反应。

实验 设计：32HER-2/纽+、去势敏感和抗去势前列腺癌患者入选。其中，29名患者完成了所有6个AE37疫苗接种周期。通过迟发型超敏反应、干扰素-γELISPOT和细胞内染色监测整个患者群体的免疫应答。调节性T细胞(Treg)频率和血浆 HER-2/纽并测定转化生长因子-β水平。对不同临床特征的患者进行免疫应答分析。在整个研究过程中，对局部/全身毒性进行了监测。

结果：未观察到2级以上毒性反应。在基于干扰素-γ的ELISPOT试验中，75%的患者对AE37疫苗产生了增强免疫力，65%的患者对未经修饰的AE36肽产生了增强免疫力。细胞内干扰素-γ分析显示AE37可激发CD4+和CD8+T细胞应答。80%的患者对AE36出现阳性的迟发性过敏反应。此外，循环Treg频率可检测到显著降低， 血浆HER-2/纽和血清转化生长因子-β水平。疾病范围较小的患者在接种疫苗时产生了较好的免疫应答 。

结论：AE37疫苗是安全的，可诱导HER-2/纽去势敏感型和去势抵抗型前列腺癌患者的特异性细胞免疫反应，因此强调了AE37靶向HER-2/的可能性。纽用于前列腺癌的免疫治疗。临床癌资源；16(13)；3495–506.

©2010 AACR。

尽管前列腺癌的常规治疗方法，如手术切除和放射治疗，许多患者最终仍会发生转移。激素剥夺最初对大多数转移性疾病患者有效(1)。然而，前列腺癌患者最终会复发，因为前列腺癌向激素非依赖性生长的方向发展。不幸的是，晚期前列腺癌对化疗的反应很差-

作者所在的 单位：1圣萨瓦斯癌症医院癌症免疫和免疫治疗中心及2泌尿外科；3希腊雅典“Helena Venizelou”妇产科医院免疫生物学 科；4马萨诸塞州伍斯特的Antigen Express，Inc.

通讯 作者：Constantin N.Baxevanis，癌症免疫和免疫治疗中心，圣萨瓦斯癌症医院，亚历山大大道171号，希腊雅典11522。电话：30-210-6409380；传真：30-210-

6409516； 电子邮件：baxevanis@ciic.gr.

DOI： 10.1158/10780432.CCR-10-0085.

©2010 美国癌症研究协会。

以紫杉烷为基础的治疗药物目前被认为是去势耐药前列腺癌的常用治疗方法 (2)。因此，需要新的方法来预防和/或有效治疗晚期前列腺癌患者。

前列腺经常弥漫性地浸润CD4+和CD8+T细胞(3，4)，这表明前列腺癌可能是免疫治疗的一个有吸引力的靶点。事实上，已经报道了几种前列腺特异性基因产物，它们可能作为肿瘤/组织抗原发挥功能(5-7)。前列腺癌的主动免疫疗法使用了多种方法来增强对前列腺癌相关抗原的免疫应答。其中，最有希望的药物包括Prostvac和APC8015(Provenge)。Prostvac-VF由两个重组病毒载体组成，每个载体编码前列腺特异性抗原(PSA)的转基因。在两个阶段的II期研究中，Prostvac-VF免疫疗法耐受性良好，

针对(自身)肿瘤蛋白的翻译相关性耐受机制阻碍了强大的抗肿瘤反应的产生，因此 是肿瘤免疫治疗的主要限制因素。克服这种耐受机制的一种方法是提高含有肿瘤蛋白表位的合成肽疫苗的免疫原性。在I期临床试验中，我们通过II-Key/HER-2/提供了免疫激活 信号纽(776-790)(AE37)多肽/粒细胞巨噬细胞集落刺激因子杂交瘤苗在前列腺癌中的应用我们描述了这种组合在这些患者中的安全性和疫苗诱导的免疫力。 我们的结果表明，AE37杂交肽/粒细胞巨噬细胞集落刺激因子疫苗策略在诱导针对HER-2/HER-2的免疫应答方面是安全和有效的。纽蛋白。这些观察结果表明，有必要在一项随机的II期临床试验中对AE37进行进一步研究，在该试验中，可以评估疾病进展时间方面的临床益处 。

乳腺癌患者，对疫苗表现出很强的免疫学反应。

在前列腺癌中，几项研究报告增加了HER-2/纽在临床局限性和更晚期激素难治性疾病患者中的表达(22-24)。除了刺激细胞分裂外，HER-2/纽此外，在雄激素存在的情况下，通过激活雄激素受体通路，使前列腺癌细胞的恶性潜能增加，从而促进去势耐受前列腺癌的发生。 (25) 也可通过激活雄激素受体途径增加前列腺癌细胞的恶性潜能，从而促进去势耐受前列腺癌的发生。的确，临床研究表明前列腺癌向雄激素非依赖性进展的特征是HER-2/纽表达式(26，27)。 因此，HER-2/纽靶向治疗为前列腺癌患者提供了一种很有前途的治疗干预手段。主动免疫疗法提供了额外的好处，因为特定激活的免疫细胞可以识别和杀死表达较低水平HER-2/的肿瘤细胞纽比赫赛汀识别所需的要多。我们在此报告对AE37免疫的前列腺癌患者进行的第一次试验的结果。

材料和方法

与男性转移性去势耐受前列腺癌患者的死亡率显著降低和中位总存活率提高有关(8，9)。 与转移性去势抵抗前列腺癌患者的死亡率显著降低和中位总存活率提高相关(8，9)。APC8015是一种新型的免疫治疗药物，由自体树突状细胞冲击而成。离体以粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和前列腺酸性磷酸酶(PA2024)重组融合蛋白PA2024为免疫原剂。两项III期随机临床试验显示，对激素转移性难治性前列腺癌患者(10，11)有生存益处。一种增强MHCⅡ类表位多肽的效力的新方法 现已以II-key/MHCⅡ类杂交肽的形式出现(12)。这类II-Key杂交肽包含II蛋白的免疫调节片段，催化MHC II类表位直接充电到肽结合槽， 避免了细胞内表位处理的需要(13)。第二免疫调节区的最短活性序列 由四个氨基酸组成[LRMK(II-键肽)；参考文献12个]。这个II-关键片段与MHCⅡ类抗原表位的Cova连接显著增强了抗原提呈(13-16)。我们实验室的研究表明，HER-2/纽(776-790) 表位作为一个引人注目的肿瘤抗原，CD4+T细胞被合成的HER-2/纽(776-790)肽 帮助自体CTL增强抗肿瘤活性(17-19)。在一系列研究(14、17-20)中，我们发现 II-Key/Her-2/纽(776-790)杂交种(AE37)诱导更强的免疫应答体外培养和在 活体中与未修饰的HER-2/纽(776-790)肽(AE36)。最近，福尔摩斯等人。(21)对HER-2/AE37杂交肽进行了一期研究。纽-正向

患者群体、临床方案和研究设计

希腊国家医药组织批准了第一阶段临床试验方案，研究编号为 IS107/2006，EudraCT2006-003299-37。采用免疫组织化学(IHC)法检测患者原发肿瘤组织中HER-2/Neu 表达式(27)。经过适当的咨询和书面知情同意，去势敏感和抵抗去势的前列腺癌患者与HER-2/纽+(IHC评分1+~3+)、非转移性和转移性疾病、东部合作肿瘤学(ECOG)0或1被认为是合格的。在接受治疗前，患者接受了皮肤测试。白色念珠菌(Lofarma) ，如果它们对抗原发生反应，就被认为是免疫活性的。排除标准包括：EcoG≥2患者；活动性感染；严重心血管并存；急性/慢性乙型肝炎、丙型肝炎和艾滋病；艾滋病毒血清阳性；诊断其他原发的实体/血液恶性肿瘤和影响患者依从性的任何病理共病 (例如精神障碍)；以及免疫不活跃(皮试阴性)。在每个免疫周期，患者被分配接受500μg的AE37疫苗和125μg的GM-CSF混合疫苗。AE37和GM-CSF的剂量在I期研究中被发现是最佳的 ，研究对象为无疾病、淋巴结阴性的乳腺癌患者(21例)，接种程序相似。

疫苗

II键/HER-2/纽(776-790)杂交肽AE37(Ac-LRMKGVGSPYVSRLLGICL-NH2)是根据NeoMPS公司现行的联邦良好制造规范生产的，肽纯度(>95%)通过高效液相色谱和质谱法进行了验证。(776-790)杂交肽AE37(Ac-LRMKGVGSPYVSRLLGICL-NH2)是按照NeoMPS公司现行的联邦良好制造规范生产的。无菌检测是

由制造商出品 。疫苗的制备如前所述(21)。简而言之，500μg冻干肽在0.5mL无菌生理盐水中重组，并与125μg GM-CSF(Berlex)在0.5mL中混合。将1.0mL疫苗分开，在同一肢体相距5 cm的两个部位皮内注射。所有患者每月接种6次AE37疫苗。在随后的接种中，观察到直径为100 mm的≥的局部反应 (21)，GM-CSF减少了一半。如果后一组患者在没有GM-CSF的情况下继续出现强烈的局部反应，那么多肽量也会连续减少一半。

毒性

患者 在接种疫苗后1小时观察急性变态反应，48小时后返回检查注射部位 。在所有接种的所有患者中，均评估了注射部位的局部毒性和全身毒性。 毒性采用美国国家癌症研究所不良事件通用术语标准v3.0进行分级，并按0至5分进行报告。

肽 和蛋白质

AE37肽(Ac-LRMKGVGSPYVSRLLGICL-NH2)

是II-Key肽(LRMK)与天然HER-2/纽肽AE36(aa776-790：GVGSPYVSRLL-GICL；参考文献 19)。来评估Eli引用的免疫反应体内反映了对原生HER-2/的反应性纽肽， 我们评估了针对AE36和AE37的免疫应答。白色念珠菌和商陆有丝分裂原(Sigma)作为阳性对照体外培养免疫原性检测。以单纯培养液中的外周血单个核细胞(PBMC)作为阴性对照。

ELISPOT 分析

患者在治疗前抽血建立基线(VAc)，然后在每次接种前每月，最后一次接种(VAc)后1个月 ，以及接种结束后6个月(长期)抽血 ，建立基线(Pre-Vac)，然后在每次接种前每月、最后一次接种(VAc)后1个月和接种结束后6个月(长期)抽血。采用 Ficoll梯度分离法分离PBMC。新鲜分离的PBMC在X-vivo 15培养基(Bio-Whittaker，Cambrex)中添加2%AB人血清(Sigma)，分别加入10μg/mL的AE36或AE37多肽(10 mmol g/mL AE36或AE37)或对照组(白色念珠菌，1：50；商陆，2μg/mL)，预涂干扰素-γELISPOT平板(MAB-TECH AB)，每孔2.5×10~5个细胞 。这个

在给定的接种轮次中，每孔的特定 点(即，每孔的实验斑点数减去相应 接种周期的背景孔的平均斑点数)在真空前特定斑点之上大于2SD，如果每孔的平均特定斑点数在真空前特定斑点的2SD以内，则保持 不变，如果每孔的平均特定斑点数大于真空前特定斑点下方的2SD，则每孔的特定斑点的平均数减少，而如果每孔的平均特定斑点数大于2SD，则每孔的特定斑点的平均数量在疫苗接种前特定斑点的上方大于2SD，如果每孔的平均特定斑点数在空投前特定斑点的2 SD以内，则保持 不变。

细胞内 染色

收集培养物 ，回收细胞，在室温下用别藻蓝蛋白标记的抗CD4和外膜叶绿素 蛋白标记的抗CD3抗体(BD Biosciences)染色15min。然后，根据制造商的方案，使用BD Cytofix/Cytoperm Fixation/PermeStability Kit(BD Biosciences)对细胞进行清洗、固定、通透化，并用异硫氰酸荧光素标记的抗干扰素-γ(BD Biosciences)进行染色。染色细胞用FACSCalibur和CellQuest软件(BD Bios-ciences)分析。干扰素-γ+细胞的百分比已更正为背景 。

Tregs的表型特征

患者的外周血液分别在真空吸气前、真空吸气后和长期采集。全血中Treg细胞的检测采用裂解免洗法 。简而言之，用50μL全血(肝素或乙二胺四乙酸)染色

%否患者种族100 32格里森评分低(3-6)31 10中级(7)38 12高 (8-10)31 10阶段*阶段I 0阶段II 9 3阶段III 47 15阶段IV 44 14生化阉割 敏感66 21抗去势34 11 PSA(ng/mL)10 37 9

平板 在37°C、加湿的5%CO2中孵化-

培养箱 持续40小时，并按照制造商的描述进行开发。使用ELISPOT分析仪(A.EL.VIS GmbH)对斑点进行计数。 数据如前所述计算(28)。简而言之，数据以特定的点(实验点减去背景 点；即，

PBMC 单独在介质中)每106个PBMC，或按计算

1/106个PBMC中特定点的频率 。如果在基线时，每孔的平均抗原特异性斑点在统计学上不同，则患者被认为具有预先存在的免疫力(P

图1。AE37的毒性、皮肤反应和免疫力。A，接种期间观察到的最大局部和全身毒性(根据通用术语标准进行分级 )。在整个接种过程中记录接种后48h的皮肤反应(正交均值±扫描电镜) 。

**, P = 0.0013; ***, PP

室温下预滴定CD45-Peridinin叶绿素蛋白、CD4-别藻蓝蛋白、CD25-荧光素异硫氰酸酯和CD127-藻红蛋白(均购自BD Bioscience)。红细胞用450μL氯化铵裂解液裂解，1h内在流式细胞仪上分析。Tregs是通过门控低SSC CD45+CD4+淋巴细胞，高CD25表达(高于非CD4+淋巴细胞)和CD127阴性/低表达(29)来定义的。

血浆人表皮生长因子受体胞外区和转化生长因子-β测定

血浆 样本分别在真空吸气前、真空吸气后和长期采集。使用市售免疫分析试剂盒测定转化生长因子-β

(人转化生长因子-β1即时酶联免疫吸附剂，如本德医疗系统有限公司)，和HER-2/纽细胞外域 (HER-ECD；免疫1，拜耳诊断)。

迟发性超敏反应

迟发型超敏反应(DTH)分别在接种前、接种后和长期进行。用100μg AE36皮内注射，用灵敏圆珠笔法测定48小时后的潜伏期反应和对疫苗的皮肤反应，结果采用正交平均法(21)。患者必须在真空吸气后超过5 mm才能被认为发展为阳性的潜伏期反应(21)。

图 1.续。E.接种过程中获得的个体Pre-vac和最大(最大)ELISPOT IFN-γ反应。水平 条，中位数。F、免疫后AE37和AE36特异性免疫率。灰色，增加；阴影，不变；黑色， 减少。G、预真空和最大值

ELISPOT在对AE36已有免疫力的患者中的干扰素-γ反应。H，AE37疫苗诱导的AE36持久免疫力： 平均值±SEM。干扰素-γELISPOT对AE36的长期应答与最大应答无差异。***,P

统计 分析

使用GraphPad Prism Version 4软件对数据进行统计分析。统计评价采用双尾Wilcoxon配对检验和95%置信区间的Spearman相关 检验。统计上有意义的差异被考虑 当P值为≤0.05。

结果

病人

32例HER-2/患者 纽+前列腺癌入选。患者特征如表1所示。IV期患者中有12人有骨转移。三名登记的转移性患者在病情严重恶化时停止接种疫苗(一名患者 在第二周期，两名在第三周期)。因此，29名患者完成了所有疫苗接种，可以进行免疫学评估。招待-

接种前的治疗包括手术、放疗、化疗(多西紫杉醇)和雄激素消融(比卡鲁他胺和黄体生成素激动剂)。在接种疫苗期间，19名患者没有接受任何其他治疗；5名进展性疾病患者接受了额外的化疗；其余的接受了单独的激素治疗或联合放射治疗。

毒性

所有32例患者的最大局部和全身毒性如图1A所示。我们没有观察到2级以上的毒性反应。主要的全身症状是0级，只有3名患者在第一晚出现1级发热，用扑热息痛很容易控制。局部毒性轻微，大多数患者有1级症状(注射部位疼痛，伴有轻度肿胀和瘙痒)，2级症状(注射部位肿大，有水泡)。

6例患者进行了注射(br}位点)评分。两名患者要求减少GM-CSF，一名在第一次接种后，一名在第四次接种后。最初(在第一次疫苗接种后)需要再增加一次GM-CSF降低；第二次疫苗接种后，GM-CSF被省略；最后在第四次疫苗接种时，肽减少。

皮肤 反应

在每个免疫周期(含GM-CSF的AE37)接种后48小时通过硬化法测定皮肤反应。 绝大多数患者(25/29)在第二次接种后皮肤反应逐渐增加(27/29)，所有患者在第三次免疫周期后均有反应(图1B)，第二次免疫后皮肤反应进行性增加(27/29)，第三个免疫周期后所有患者均有反应(图 1B)，且大多数患者(25/29)在第二次免疫后皮肤反应呈进行性增加(图 1B)，在第二次接种后皮肤反应呈进行性增加(图 1B)。

AE37疫苗诱导产生干扰素-γ的循环T细胞

为了研究AE37疫苗对免疫系统的影响，在接种前和接种过程中分离PBMC，然后以干扰素-γ为基础的ELISPOT分析AE37特异性T细胞的存在。图1C和D显示了外周血单核细胞来源的干扰素-γ对AE37和天然AE36肽免疫前和每轮接种期间的总体应答。应答中分泌干扰素-γ的细胞的数量如图1C和图D所示。体外培养AE37的刺激作用在第一轮疫苗接种(R1)后已经增加，并在2个月后达到峰值(即，在第三轮疫苗R3之后；图1C)。患者的外周血单个核细胞(PBMCs)也进行了评估体外培养对于干扰素-γ 请回复未经改装的AE36HER-2/纽(776-790)肽，在肿瘤细胞系和各种癌症的原发肿瘤(包括前列腺癌(18，19))上自然加工和表达。AE36 肽特异性免疫反应在第三次接种后也观察到了最大值(图1D)。图1E显示了个别患者的反应 。AE37特异性T细胞频率的中位数在33,333例中为1例(图1E)。最大反应的中位数为11765个PBMC中的1个(PP=0.0017；图1F)。在长期评估中，平均干扰素-γ对AE36的应答与平均最大应答相当(图1H)，这表明AE37疫苗诱导了持久的系统免疫。

疫苗特异性和AE36特异性的CD4+和CD8+T细胞均由疫苗诱导

通过评估患者接触AE37疫苗肽或天然AE36肽后循环T细胞细胞内干扰素-γ染色阳性的百分比，显示了对AE37疫苗肽或天然AE36肽的免疫力的发展。如图2所示，疫苗接种成功诱导了患者AE37特异性CD4+和CD8+T细胞亚群(图2A和D)。我们 还观察到响应天然AE36肽的两个T细胞亚群平行增加(图2B和E)。AE37特异性CD4+T细胞的中位数最大百分比为0.025(图2A)，AE36为0.017(图2B)。AE37和AE36的免疫前中位数均低于0.0001%。我们还观察到显著的CD8+T细胞对AE37的应答(中位数最大百分比为0.074%；P P

患者的调节性T细胞

Tregs 定义为CD4+CD25HighCD127low/−细胞(29个)。AE37肽和GM-CSF免疫后，长期内Treg频率显著降低(中位数4.89%；接种组1.30-9.00%对5.76%；Pre-vac 1.46-10.75%；图3A)，差异有统计学意义(中位数4.89%；接种后1.30-9.00%比5.76%；Pre-vac 1.46-10.75%；图3A)。与吸气前相比，吸气后Treg频率也有所降低(中位数为5.18%；范围为2.12-10.46%)，但无统计学意义(P = 0.4363).

转化生长因子-β 和HER-2/纽血浆中的胞外区水平

转化生长因子-β是一种有效的癌症患者T细胞免疫抑制剂(30)，已被证明在前列腺癌患者(31，32)的血清中升高。术前血浆转化生长因子-β中位数为9.34 ng/mL(4.11~31.84 ng/mL)。Vac TGF-β虽有下降，但无统计学意义(中位数8.46 ng/mL；范围4.42~31.99 ng/mL；P=0.4043)。然而，在长期评估中，取得了统计学上显著的下降(7.49 ng/mL； 范围2.90-

24.23br}ng/mL；图3b)重要的是，长期的百分比变化，与吸气前相比，转化生长因子-β血浆水平与循环Treg的相应百分比变化具有统计学相关性(图3C)。

HER-2/Neu 据报道，前列腺癌和乳腺癌患者血清中的细胞外区(HER-ECD)水平升高(33， 34)。本研究显示VAC后血浆HER-ECD水平明显下降(中位数

在我们的前列腺癌患者中，与吸入术前(Medi-an 9.2 ng/mL；范围6.3-15.3 ng/mL)相比，我们的前列腺癌患者的治疗效果为5.9 ng/mL；范围4.0-12.5) (图3D)。

在 活体中免疫应答

更密切地确定AE37疫苗在诱导体内免疫反应，我们

图 2.免疫后CD_4~+和CD_8~+干扰素-γ产生T细胞数量均增加。对AE37 (A和D)和AE36(B和E)的个别答复。疫苗在接种期间和长期诱导AE36特异性CD4+干扰素-γ+(C)或CD8+干扰素-γ+(F)亚群 (最大应答)。*,P

P P

测量并比较未经修饰的AE36肽在静注前、静注后和长期使用时的DTH反应。在完成疫苗接种系列的29名患者中，23名(79%)有明显的Vac DTH反应(>5 mm)，Vac后硬结直径的中位数为11.5 mm(范围0.5-38.75 mm)，而Vac后硬结直径的中位数为

基线位置0.0 mm(范围0.0-8.0 mm)(图4)。我们没有观察到长期DTH反应(中位数10.0 mm；范围0.5-45.0 mm)与真空DTH后相比有任何显著变化(图4)。

AE37诱导免疫在不同患者组间的比较

对患者 进行回顾性分层以进行数据分析，这可能有助于在 II期临床试验之前为患者选择提供洞察力。回顾性分层通过分期进行。[即II-III期(非稳定期患者)与IV期(晚期患者)]，通过对睾酮降低的反应(即，对去势敏感和抵抗去势)， 和HER-2/纽表达式(即HER-2/纽IHC 1+和2+的低表达基因与HER-2/neuIHC3+的过表达基因 。从图5可以看出，有一种更好的趋势。体外培养和体内以下人群对接种疫苗的免疫反应

疾病进展较慢的患者 。ELISPOT检测到，接种AE37后产生特异性干扰素-γ的T细胞的最大增幅(以基线水平的平均倍数表示)，在II-III期(图5A) 和去势敏感(图5B)患者分别高于IV期和去势抵抗患者，尽管这种差异在统计学上并不显著。简单地说，第IV期患者对疫苗的DTH反应，即真空吸气后减去基线DTH的差值，在统计学上显著较低(图5D)，在去势抵抗患者中也较低(尽管在统计学上不显著)(图5E)。有趣的是，HER-2/患者的干扰素-γ反应纽-与HER-2/低表达的患者相比，首次诊断时高表达的肿瘤显著减少(具有统计学意义)Neu 在他们的活检组织中表达(图5C)。然而，对于HER-2/，DTH响应没有统计上的显著差异 。纽表达式(图5F)。

考虑到 这样的体外培养(干扰素-γ)或体内(Br)免疫应答可能受到肿瘤抑制环境的影响，我们还评估了同一组患者在接种疫苗前(基线值)的血浆转化生长因子-β水平和Treg频率。提高基线

在进展期(即IV期(图5G)和去势抵抗(图5H))的患者中记录了转化生长因子-β的血浆浓度，与II-III期和去势敏感的患者相比，虽然没有达到统计学意义。在任何患者组中都没有记录到吸气前Treg频率的差异 (图5J-L)。

讨论

我们 在此报告评估HER-2/的安全性和免疫活性的I期试验结果。纽杂交肽(AE37)疫苗(AE37)在去势敏感和抗去势、转移性和非转移性前列腺癌患者中的应用。这种治疗与明显的不良反应无关；正如预期的那样，患者会出现局部注射部位反应， 和一些体征较轻的症状，如发烧。

在 第一个晚上。大多数患者产生了针对AE37和天然HER-2/的T细胞(CD4+和CD8+)免疫反应。纽(776-790)(AE36)肽。

这项关键技术旨在通过促进细胞表面MHC第二类分子中的多肽交换来增强抗原肽的呈递能力(13)。因此，AE37杂交肽[Ii-Key/Her-2/纽(776–790)] 能够用HER-2/中存在的表位直接给HLA-DR等位基因充电纽(776-790)，从而诱导更强的免疫应答体外培养和抗肿瘤免疫体内而不是天然的AE36肽。事实上，我们已经证明，与AE36相比，AE37在癌症患者外周血单个核细胞中诱导更高频率的干扰素-γ+cd4+应答细胞，并为自体CTL裂解肿瘤细胞提供明显更强的帮助。体外培养和体内 (18，19)。此外，据报道，AE37混合疫苗能够诱导出很强的免疫力。

图 3.无创手术前、后和长期的生物学和免疫学参数。A，循环Tregs。血清转化生长因子-β(B)和HER-ECD(D)水平。C、长期比较转化生长因子-β的百分比变化与Treg频率变化的百分比之间的相关性 与VAc前的值相比较 。水平线条，中间值。*,P

***, P

图 4.潜伏期前、真空后和长期。长方体和胡须(5%-95%)图。水平条，中值；垂直 条，范围。

***, P

HER-2/纽-乳腺癌患者试验中的特异性免疫反应，即使在没有GM-CSF的情况下也是如此(21)。肽疫苗试验主要集中在刺激CTL，通过给药8-10个与HLA-I类等位基因结合的聚体。这种疫苗诱导的CTL可以直接杀死肿瘤细胞，但缺乏持久的免疫力(35)。这种AE37肽疫苗专注于刺激CD4+T辅助细胞，目的是诱导免疫记忆和持续刺激CTL。Disis等人已经报道了使用第二类多肽疫苗的临床研究。(36)乳腺癌。HER-2(776-790)的II密钥修饰 已用于接种无疾病、淋巴结阴性的乳腺癌患者(21例)。在黑色素瘤方面，也有二类肽 疫苗正在进行临床试验(37，38)。这是第一次使用

前列腺癌患者的关键修饰。

HER-2/纽(776-790)肽由许多HLA-DR等位基因(39)混杂存在。理论上，这种呈现方式 可以反映一个表位与许多HLA-DR等位基因结合，和/或多个紧密重叠但略有偏移的HLA-DR表位。 无论哪种情况，AE37疫苗似乎都提高了T细胞激活的表型和效力，而与HLA等位基因无关。 II-Key(LRMK)部分是否真的会给AE36带来额外的MHC II类乱交，还需要进一步调查。有趣的是，我们的细胞内干扰素-γ分析数据检测到由患者的CD8+T细胞介导的有效反应，提示AE37AE37疫苗除了CD4+T细胞外，还能激活CD8+T细胞。对天然AE36肽也检测到这样的反应，这表明AE37中的II-键部分增强了针对HER-2/MHC类I结合基序序列的免疫力。纽(776-790)(由算法预测软件建议)。此外，CD8+T细胞在应答AE37时产生的干扰素-γ也可能被触发。

通过将II-KEY连接到AE36而产生的MHC“新决定因素”。虽然这一点必须得到证实，但我们的数据表明，考虑到与AE36相比，AE37的应答者干扰素-γ+细胞的频率更高，情况可能就是这样。我们的疫苗配方诱导针对AE37和/或AE36的特异性T细胞反应的功效已被大量增强免疫反应的患者 所证实。 我们的疫苗配方能够诱导针对AE37和/或AE36的特异性T细胞反应，这一点已被大量增强免疫反应的患者证实。这种反应通常在第三轮疫苗接种时达到峰值，然后下降。 一种可能性是，在多次接种疫苗后，疫苗诱导的T细胞亚群获得了不同的杀伤或归巢特性，它们选择性地粘附到不同的身体部分，包括淋巴结、骨髓和/或肿瘤组织(40)。

刺激CD4+T辅助细胞对于诱导长期免疫至关重要。在我们的大多数接种疫苗的患者中，我们都能检测到对AE36的特异性免疫。体外培养(干扰素-γ)和体内(DTH)甚至在接种完疫苗后6个月 系列。然而，接种MHCⅡ类限制性多肽可能会额外激活Tregs，而Tregs在前列腺癌患者中已经升高(41-43)。通过在我们的AE37试验中监测循环Tregs，我们检测到接种后Tregs的频率减少了 ，这在长期评估中更加明显。此外，TREG频率的降低与转化生长因子-β血浆水平的降低相关，提示AE37疫苗可有效地调节肿瘤诱导的免疫抑制环境。与疫苗接种后6个月(长期值)相比，Tregs和转化生长因子-β的表达在6个月后下降更多(br})，这一事实表明疫苗所触发的持续免疫反应可能不仅仅是针对靶向表位(AE36)，而是针对广泛的肿瘤相关特异性(表位扩散)(表位扩散)，而不是仅仅针对靶向表位(AE36)，而是针对广泛的肿瘤相关特异性(表位扩散)，这一事实表明疫苗引发的免疫反应正在进行中，可能不仅仅是针对靶向表位(AE36)，而是针对广泛的肿瘤相关特异性(表位扩散)。在给转移性乳腺癌患者接种MHCⅡ类限制性HER-2疫苗时，也有报道出现这种情况。纽多肽(28)。

HER-ECD 血清水平在前列腺癌患者中被证明是升高的，并且被证明是一个独立的预后因素，与生化复发的高风险相关(33)。出于这个原因，在登记时和疫苗接种完成后测定血浆HER-ECD水平是很有意义的。总体而言，Vacine引起的HER-ECD血浆水平显著降低。 由于患者数量有限，我们无法检测到不同临床特征的患者之间的任何统计学差异。 由于患者数量有限，我们无法检测到不同临床特征的患者之间的任何统计学差异。将需要进一步的临床研究来澄清这种下降的原因。

通过对我们的患者进行回顾性分析，根据他们登记前的特征，即阶段，对生化的敏感性，或HER-2/neu的表达，我们已经检测到疾病的程度和HER-2/neu的表达之间的相关性。 我们根据登记前的特征，即阶段，对生化的敏感性，或HER-2/neu的表达，对我们的患者进行回顾性分析，发现疾病的程度与体外培养 和体内AE36疫苗诱导的免疫应答。晚期、IV期和/或去势抵抗的患者 表现出循环中产生干扰素-γ的细胞减少和真空潜伏期后反应降低。之前已记录 (44)

图 5.根据分期(II-III期与IV期)、敏感性、 或对睾酮降低的抵抗力(分别为去势敏感与抗去势)以及肿瘤的HER-2/水平，对接种疫苗的患者的免疫参数进行比较纽表达(HER1+2+与HER3+)。从A到C，结果表示最大比特异点除以吸气前特异点 。D到F，结果代表真空后潜伏期减去无功前潜伏期。G~I，血浆转化生长因子-β浓度。J到L，循环 树的百分比。在未指明的情况下，组内比较没有统计学意义。总共，所有的病人。条形，平均值 ±SEM。**,P

癌症进展导致肿瘤介导的局部和全身免疫抑制，导致抗肿瘤免疫功能受损。事实上， 我们在本研究中发现，晚期疾病(IV期和/或去势耐受)患者的预防基线血浆转化生长因子-β水平升高，至少部分解释了这些群体中敌意环境导致AE37疫苗诱导的免疫反应下降的部分原因。相比之下，在不同的 组中检测到相似的外周血树突状细胞百分比。我们的数据与横川等人的数据是一致的。(42)发现前列腺癌局部或晚期患者外周血中Treg群体无明显差异，但转移性患者的Treg细胞更具抑制性(br})。(2)研究发现，转移性前列腺癌患者外周血中Treg细胞数量无明显差异，而转移性前列腺癌患者外周血Treg细胞更具抑制性。

此前有报道称，HER-2/低的乳腺癌患者纽(IHC 1+)表达肿瘤对E75疫苗的应答优于HER-2/纽IHC 2+和3+，提示在高HER-2/中存在免疫耐受因素。纽表达者(45)。在本研究中，我们还发现，在(IHC3+)HER-2/高的患者中，产生INF-γ的细胞显著减少，潜伏期反应也较低(尽管在统计学上没有显著意义)。纽表达式 与HER-2/纽IHC 1+和2+。考虑到接种疫苗的患者数量少，他们的异质性，以及各种治疗类型，很难确定免疫反应的发展和临床反应之间是否存在联系。因此，我们无法检测到疫苗特异性免疫应答与PSA水平或总体存活率/无进展存活率之间的显著关联(数据未显示)。此外，大多数患者(29人中有13人，其中12人在治疗期间没有接受任何治疗

疫苗接种)， 在进入研究时，PSA值可以忽略不计，在相对较短的疫苗接种期间一直保持在较低的水平(低于0.2 ng/mL) 。显然，这可能是(a)以前的疗法，(b)疫苗，或(c)其组合 。

结论：AE37免疫治疗性疫苗的使用是治疗前列腺癌的一种新策略。这项临床试验表明，该疫苗是安全的，具有免疫活性。然而，临床益处的证明将需要在疾病范围较小的同质组患者中进行第二阶段试验，包括无病复发风险较高的患者。

披露潜在利益冲突

N.L. Kallinteris和E.von Hofe：所有权权益，Generex Biotechnology。

致谢

我们 感谢我们的患者自愿参与这项研究。我们感谢圣萨瓦斯肿瘤医院生化科主任Angela Ferderigou博士为我们提供患者的PSA数据，并感谢Joanne Calogeropoulou提供出色的技术 帮助。

授予 支持

抗原快递公司，以及区域运营计划Attika No20，MIS代码59605GR(M.Papamichail)的赠款。

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收到 2010年1月13日；修订为2010年6月6日；已接受2010年5月7日；发布时间为2010年5月13日。

参考文献

转移性雄激素非依赖性前列腺癌。“前列腺2002”；53：109-17。

将II-Key片段与gp100(46-58)表位连接可增强表位特异性抗体的产生。疫苗2005；23：2336-8。

Salguero PM，Codes-Manuel de Villena M.转化生长因子β在癌症微环境中的作用。Clin Transl Oncol2009；11：715-20。